浅谈神经系统遗传性疾病基因诊断策略及问题

李洵桦 陈定邦 吴超

.专题综述.

浅谈神经系统遗传性疾病基因诊断策略及问题

李洵桦 陈定邦 吴超

神经系统遗传性疾病临床症状复杂、诊断困难,基因检测是明确诊断的终极手段.近年来分子诊断技术的进步、方法的更新,尤其是二代基因测序技术的广泛应用,使从众多检测方法中选择适宜的基因检测方法成为临床医师的新挑战.本文拟从疾病临床表型出发,结合不同基因突变和基因检测方法,对神经系统单基因遗传病基因诊断策略及问题进行综述.

遗传性疾病,先天性; 神经系统疾病; 基因; 综述

迄今已经确定的单基因遗传病近5000种,其中大多数累及神经系统,导致神经系统遗传性疾病.神经系统遗传性疾病种类繁多且罕见,临床症状复杂,具有高度遗传异质性和临床异质性,且各种疾病之间症状常重叠,故临床诊断困难,基因检测是明确诊断的终极手段.近年来,分子诊断技术的不断进步,尤其是二代基因测序(NGS)技术的广泛应用,使基因检测成本降低、时间减少,然而如何从众多方法中选择适宜的基因检测方法成为临床医师面临的新挑战,本文拟对神经系统单基因遗传病基因诊断策略和问题进行综述.

一、传统基因检测技术的合理选择

传统基因检测技术根据临床表型特征,对候选基因逐个排查,检测成本高且检测时间长,二代基因测序技术可以显著降低检测成本、减少检测时间,尤其对于种类众多的致病基因.然而对于某些单基因遗传病,靶向单基因检测仍作为首选,这些疾病一般具有如下特征:(1)临床特征明显,可以结合血液生化、影像学等辅助检查明确诊断;家族史明确;确定为单基因致病性突变[1].临床明确诊断后,单基因检测阳性检出率较高,如ATP7B基因突变导致的肝豆状核变性[HLD,亦称Wilson病(WD)]和DMD基因突变导致的Duchenne型肌营养不良症(DMD).2016年,Dong等[2]报告大样本肝豆状核变性病例的ATP7B基因检测结果,90.03%患者(569/632)存在2种或以上病理性或可能病理性变异,其中93.85%(534/569)存在14种最常见病理性变异中至少1种,可见单基因检测对肝豆状核变性的检测效率较高.(2)目前尚有部分遗传性疾病不适宜二代基因测序,如三核苷酸重复突变导致的疾病、亨廷顿病(HD)、部分脊髓小脑共济失调(SCA)、脆性X染色体综合征(FXS)等;较大缺失或重复突变导致的疾病如Duchenne型肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症(SMA)、腓骨肌萎缩症1A型(CMT1A型)等;基因不明确需特殊检测,如面⁃肩⁃肱型肌营养不良症(FSHD)等.

选择传统基因检测要求临床医师必须具备充足的特殊基因突变致临床表型的相关知识和丰富的临床经验,以及作出正确诊断,极具挑战性.以腓骨肌萎缩症为例,包括PMP22基因在内的长度为1.50 Mb串联重复突变导致的CMT1A型是最常见类型,占40%～50%,约70%常染色体显性遗传性CMT1型和90%散发性CMT1型为CMT1A型[3].Saporta等[4]研究显示,英国和美国CMT1型患者PMP22基因突变阳性检出率均超过70%,特别是具有典型临床症状且正中神经神经传导速度(NCV)为15～35 m/s的CMT1型患者,PMP22基因突变阳性检出率高达89%,因此,对于正中神经神经传导速度为15～35 m/s的CMT1型患者,应首选PMP22基因检测,若呈阴性再行其他靶向基因测序.但是由于临床医师和电生理学医师存在技术差异,准确分型成为难点,若PMP22基因呈阴性,再进一步行靶向基因测序套餐检测,检测成本可能更高、检测时间可能更长[4],因此,对于经验不足的临床医师和某些难以临床诊断的病例,应直接选择二代基因测序技术更为便捷.

二、基于二代基因测序的目标区域捕获测序

二代基因测序是一种高通量测序技术,一次运行即可产生数以亿计的短片段序列,显著缩短大规模基因测序时间.通过一系列寡核苷酸探针与全基因组DNA杂交,将基因组特定区域富集,同时进行二代基因测序,是目前应用最广泛的目标区域捕获测序技术.通过检索数据库和文献,筛选出某个临床表型的所有相关致病基因,针对各目标基因外显子区域进行基因测序,可以涵盖与个体临床表型相关的大部分变异.从传统基因检测一次仅能检测一种基因到二代基因测序检测一个基因组(panel),不仅降低检测成本、节省检测时间、提高DNA诊断敏感性,而且简化临床医师选择基因检测的策略.关于基因组的选择,首先,确定与疾病有较强的关联性、有充足的解读依据,且已作为单基因检测;其次,将临床表型重叠但致病基因不同的一组疾病进行基因组检测,可资鉴别诊断[1].与全基因组测序(WGS)和全外显子测序(WES)相比,目标区域捕获测序更加简便、经济,成为目前临床基因检测的重心,广泛应用于神经系统遗传性疾病的基因检测.

1.腓骨肌萎缩症 亦称遗传性运动感觉神经病(HMSN),是基因型和临床表型异质性较强的周围神经系统遗传性疾病,致病基因50余种,存在多种遗传方式.既往推荐的基因诊断策略主要是根据临床表型和遗传方式再结合基因突变频率选择相应基因检测[5].PMP22基因突变导致的CMT1A型是腓骨肌萎缩症的最常见亚型(占40%～50%),其次是MPZ基因点突变导致的CMT1B型(占3%～5%)[6],而绝大多数X连锁遗传性腓骨肌萎缩症为GJB1基因突变所致,是第2位常见亚型(占7%～12%),因此,对于常染色体显性遗传性CMT1型和散发性CMT1型患者,首先检测PMP22基因大片段重复突变,若呈阴性且家系中无男男遗传,则考虑CMTX1型并检测GJB1基因,若呈阴性,则行MPZ和PMP22基因点突变分析,若仍呈阴性且条件允许,则进一步行常染色体显性遗传性CMT1型其他致病基因如SJMPLE、EGR2、NFL突变分析.由于腓骨肌萎缩症的遗传异质性,传统基因检测效率较低;随着二代基因测序技术的发展和检测成本的降低,通过目标区域捕获测序技术可以进行基因组检测,通常将各致病基因外显子和侧翼序列作为目标序列同时检测,既降低检测费用,又保证绝大部分致病基因的阳性检出率,而且也减少意义不明的基因突变分析.其缺点是与全基因组测序和全外显子测序相比,无法发现新的致病基因.

2.遗传性痉挛性截瘫 遗传性痉挛性截瘫(HSP)是较罕见的具有高度临床异质性和遗传异质性的神经系统遗传性疾病,除表现为双下肢痉挛性截瘫的上运动神经元损害外,还可以合并多种神经系统及其他系统损害,且与某些神经系统遗传性疾病的临床表现相重叠,因此,即使是临床经验丰富的神经科医师也难以鉴别诊断.目前已克隆的基因有70余种,逐一检测,选择困难且耗时、费力.SPG4型是西方国家最常见的遗传性痉挛性截瘫亚型,系SPASTIN基因突变所致[7],占40%以上,其次是ATL1基因突变导致的SPG3A型[8],再次是REEP1基因突变导致的SPG31型[9],均为常染色体显性遗传;而SPG11型、SPG7型和SPG5型是最常见的常染色体隐性遗传亚型[10],其中,SPG7型表现为突出的小脑症状,SPG5型为单纯型遗传性痉挛性截瘫,SPG11型为单纯型遗传性痉挛性截瘫伴胼胝体变薄.因此,对于常染色体显性遗传家系,应依次检测SPG4、SPG3A和SPG31基因;对于常染色体隐性遗传家系,应结合临床症状,检测SPG11、SPG7和SPG5基因;对于散发性或家族史不明确的患者,应优先检测SPG4和SPG5基因[11].二代基因测序技术可以同时对多个甚至所有已知的遗传性痉挛性截瘫致病基因进行检测,显著优化基因检测策略.2013年,Kumar等[12]采用目标区域捕获测序对27例SPG4基因阴性的遗传性痉挛性截瘫患者进行10种常染色体隐性和9种常染色体显性致病基因检测,发现7例(25.93%)呈阳性结果.Balicza等[13]采用目标区域捕获测序结合全外显子测序对58个遗传性痉挛性截瘫家系的先证者进行基因检测,结果显示,20例(34.48%)明确诊断.Koutsis等[14]对1例遗传性痉挛性截瘫患者进行2731种已知基因检测,发现1种新的致病基因--ABCD1基因.根据目前的技术条件,从经济角度考虑可以先检测SPG4基因,若呈阴性,再采用二代基因测序技术进行其余基因检测,若仍呈阴性,则可以考虑行所有致病基因目标区域捕获测序或全外显子测序.

3.原发性肌张力障碍 原发性肌张力障碍是单基因遗传病,目前文献报道有27种肌张力障碍基因位点,即DYT1～27型.不同基因型致病机制不同,治疗效果也不尽相同,因此,通过基因检测确定基因型十分重要.既往通常根据临床特点选择基因,如DYT1型于儿童期或青春期发病,肌张力障碍逐渐自单侧肢体进展至全身;DYT5型为多巴反应性肌张力障碍(DRD),表现为晨轻暮重,对左旋多巴反应极佳;DYT8～10型为发作性肌张力障碍,其中DYT10型抗癫药物(AEDs)治疗有效.随着二代基因测序技术的发展,基因诊断更加简便、直接,并且在发现新的致病基因和致病性突变中发挥重要作用,Fuchs等[15]采用全外显子测序发现DYT25型致病基因为GNAL基因;随后Zech等[16]采用该项技术发现DYT27型致病基因为COL6A3基因.如果根据某种特定临床表型检测相关基因后未发现阳性结果,可以选择目标区域捕获测序对所有已知基因进行检测.值得注意的是,对于原发性肌张力障碍,应严格把握基因检测指征,首先确定为肌张力障碍,其次排除继发性肌张力障碍,这是由于其他因素如药物不良反应、毒物毒性作用及其他遗传性疾病也可以引起肌张力障碍,如肝豆状核变性.进行目标区域捕获测序前,若患者存在特定临床表型,可以选择相应诊断性治疗方法,如左旋多巴对多巴反应性肌张力障碍有戏剧性改善效果,卡马西平对发作性运动诱发性运动障碍(PKD)有显著疗效.如果上述诊断性治疗方法仍不能明确诊断或无助于筛选候选基因,则可以考虑采用目标区域捕获测序对所有DYT基因进行检测.

4.遗传性肌病 遗传性肌病具有高度临床异质性和遗传异质性,主要包括肌营养不良症、先天性肌病、代谢性肌病、神经⁃肌肉接头病和离子通道病等,临床表现复杂且常重叠,相关致病基因种类众多,且部分基因较大、外显子较多、致病性突变位点繁多.尽管肌肉病理学检测有助于候选基因的选择,但技术要求高且费用昂贵,常不能满足诊断需求.传统基因检测需根据临床表型逐个检测候选基因,耗时长、费用高,因此,遗传性肌病整体基因诊断率较低.目标区域捕获测序技术的高通量、高选择性、低成本优点对遗传性肌病的分子诊断具有明显优势.2015年,傅晓娜等[17]采用目标区域捕获测序对134例遗传性肌病患儿进行125种相关基因检测,74例确定致病性突变,阳性检出率达55.22%,包括代谢性肌病、先天性肌病、Duchenne型肌营养不良症、Emery⁃Dreifuss肌营养不良症(EDMD)、先天性肌营养不良症(CMD)、抗肌萎缩蛋白病、肢带型肌营养不良症(LGMD)等,其中先天性肌营养不良症包括先天性肌营养不良症1A型(MDC1A型)、Ullrich型先天性肌营养不良症(UCMD)、Bethlem肌病、核纤层蛋白相关先天性肌营养不良症等.Tian等[18]采用目标区域捕获测序技术对35个肌病家系进行238种相关基因检测,包括代谢性肌病、先天性肌无力综合征、先天性肌病、先天性肌营养不良症、先天性肌强直、运动神经元病(MND)、腓骨肌萎缩症等,21个家系(60%)存在临床表型⁃基因型相匹配的致病性突变,8个家系(22.86%)存在可疑致病性突变.2016年,Kuhn等[19]对58例拟诊肢带型肌营养不良症但无法临床分型的患者进行目标区域捕获测序,包括23种LGMD基因和15种导致近似表型的基因,19例(76%)明确诊断.上述研究结果提示,当特异性临床表型足以指向某一具体疾病或基因时,应首先选择特定基因诊断,例如,Duchenne型肌营养不良症通常于幼年发病,腓肠肌肥大,血清肌酸激酶(CK)水平明显升高,肌肉病理学显示抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达缺失,均支持诊断,此时可以直接行DMD基因检测而不必要行基因组检测.如果临床表型提示为一组疾病,如肢带肌和四肢近端肌无力和肌萎缩,血清肌酸激酶、肌电图和肌肉组织活检提示肌源性损害,临床疑诊肢带型肌营养不良症,可以考虑行LGMD基因组检测,如果不能准确分型,则可以考虑目标区域捕获测序检测所有相似表型的基因,较逐一检测成本低、时间短.

三、全外显子测序或全基因组测序

高通量测序技术的发展和检测成本的降低,使全外显子测序和全基因组测序在神经内科临床和科研中得到广泛应用.全外显子测序系通过序列捕获技术将全基因组外显子区域靶向捕获并富集,再进行高通量测序的基因组分析方法[20].人类基因组约含3X109个碱基对,其中仅1%～2%DNA序列编码蛋白质,约85%的遗传变异集中于蛋白编码区,即外显子.因此,全外显子测序可以确定大多数罕见神经系统疾病的致病基因[21].全基因组测序可以获得非编码区信息,是对全外显子测序的重要补充,但检测成本较高,而且由于涉及大量非编码序列,信息量较大、基因分析较复杂[22].

对于单基因遗传病,特别是能够通过单个基因或基因组明确诊断的疾病,采用全外显子测序甚至全基因组测序,一方面耗费人力和物力,另一方面不能保证足够的测序深度和广度,使测序敏感性下降.例如,对于有明确家族史的共济失调患者,基因组检测即可检出常见基因突变,仅当基因组检测呈阴性时,方启动全外显子测序,此时有可能发现新的基因突变位点,如SCA35型致病基因TGM6基因[23].因此,临床表型难以确定某一基因组的疾病;存在多系统症状的疾病,如伴共济失调的痉挛性截瘫(痉挛性截瘫基因组检测呈阴性);经常规基因检测或表型相关基因组检测未发现基因突变而临床表型高度提示单基因遗传病,方启动全外显子测序或全基因组测序[1].值得注意的是,由于捕获效能的原因,无论是全外显子测序还是全基因组测序均无法覆盖全部外显子和基因组,因此应检测单核苷酸变异或长度不超过8～10 bp的多核苷酸变异,而不应检测致病性重复序列或长片段缺失.鉴于此,临床医师在制定全外显子测序和(或)全基因组测序前,应首先仔细分析家族史,明确核心症候群,再广泛查阅相关文献,谨慎决定[20].通常有25%～60%进行全外显子测序的患者能够确定致病基因[20,24],然而,测序的同时可以产生大量不确定的基因突变,对其致病性的解读应严格按照国际标准与指南[25].还应注意的是,基因检测结果的解读是动态发展的,随着科学知识的积累,数据意义常发生变化,因此,对于关键的候选致病基因,严密的功能学试验有助于确定其致病性并寻找适宜的干预措施.

全外显子测序和(或)全基因组测序的应用可以显著加速发现疾病新基因的进程,但测序策略的合理选择是筛查致病基因的重要保障.对于常染色体隐性遗传性疾病,分析基因检测结果时应首先考虑纯合突变和复合杂合突变;对于常染色体显性遗传性疾病,全外显子测序常检测到大量候选杂合突变,故应结合多种策略进一步确定致病性突变.当疾病基因异质性明显时,基因检测策略即显得更加重要.筛查家族性帕金森病致病基因时,常通过大家系或数目众多的正常对照确定可能的致病基因,如VPS35和DNAJC13基因[26⁃27].在无足够大家系的情况下,Farlow等[28]设计两阶段研究方案,包括1个拥有32个帕金森病家系93例帕金森病患者的发现组和1个拥有49例帕金森病患者的重复组,进行全外显子测序,结果显示,发现组患者TNK2和TNR基因的可能致病性突变亦见于重复组;发生上述突变的12个家系中TNK2和TNR基因共检出9种变异,均经Sanger测序证实可能是帕金森病新的可疑致病性突变.

高通量测序技术的推广必将加速罕见病新的致病基因的发现,同时也将带来新的问题和挑战:(1)全外显子测序可以缩短病因筛查过程,但在绝大多数情况下,寻找到致病性突变并不意味治愈患者.(2)全外显子测序有时可以意外发现与主要疾病无关的致病性突变,此时临床医师应根据临床需求进行医疗监控,甚至启动必要的治疗措施.(3)全外显子测序并未覆盖全部基因组序列,即使呈阴性结果也不能完全排除某种遗传学病因.因此,当基因检测得不到确定结论时,临床医师和遗传咨询师有责任帮助患者及其家属正确看待检测结果[29⁃30].

四、染色体微阵列分析

染色体微阵列分析(CMA)技术可以检测人类基因组DNA重复和缺失的拷贝数变异(CNV),是一种分子核型分析技术,可以检出核型分析检测不到的基因组微缺失或微重复变异.根据芯片设计与检测原理的不同,染色体微阵列分析技术可以分为两种类型:基于微阵列的比较基因组杂交(aCGH)技术和单核苷酸多态性微阵列(SNP array)技术[31],主要用于检测大片段缺失和重复,适用于孤独症谱系障碍(ASDs)、儿童精神发育迟缓、先天性畸形等.

染色体微阵列分析技术应用前,儿童精神发育迟缓和先天性畸形的病因诊断是临床医师的难题,近10年来其诊断率有所提高.Sagoo等[32]的Meta分析显示,13 926例经核型分析无异常的精神发育迟缓和先天性畸形患儿中约10%经染色体微阵列分析检出致病性突变.袁海明等[33]对2000例先天性缺陷(包括智力低下、发育迟缓、多发性畸形、自闭症、癫等)患儿进行染色体微阵列分析,阳性检出率达26.10%(522/2000).Roberts等[34]对215例孤独症、孤独症谱系障碍、发育迟缓或学习障碍患者分别进行包含105X103和180X103个探针的寡核苷酸微阵列分析,结果显示,45例(20.93%)拷贝数变异,包括49种,其中32种确定为致病性拷贝数变异,余17种临床意义不明.Schaefer等[35]对68例孤独症患儿进行染色体微阵列分析,拷贝数变异阳性检出率为20.59%(14/68).文献报道的染色体微阵列分析对孤独症和学习障碍的阳性检出率高于核型分析和脆性染色体检测.Michelson等[36]总结1980-2009年的7000篇文献采用不同检测方法对全面性发育迟缓(GDD)和智力障碍患儿的阳性检出率,染色体微阵列分析为7.8%,G显带核型分析为4%,亚端粒荧光原位杂交(FISH)为3.5%;约10%患儿系X连锁基因突变所致,其中在有确切X连锁家族史的男性患儿中约42%可以检出X连锁基因突变,例如,2%轻至中度智力障碍患儿可以检出FMR1基因全扩增,1.5%中至重度全面性发育迟缓或智力障碍女性患儿可以检出与Rett综合征相关的MeCP2基因突变.染色体微阵列分析可以用于特发性全面性癫的遗传风险评价.特发性全面性癫约占所有癫的30%,虽然预测与遗传因素有关,但绝大多数未检出致病基因.研究显示,有1.0%～1.3%单纯特发性全面性癫患儿(排除孤独症、情感障碍和严重智力障碍)可以检出15q13.3区域CHRNA7基因缺失,该突变与智力障碍、孤独症和精神分裂症有关[37⁃38].染色体微阵列分析还可以用于其他神经系统疾病的风险评价,Shoichet等[39]采用基于微阵列的比较基因组杂交技术检测72例散发性肌萎缩侧索硬化症(ALS)患者,检出11种长度<1 Mb的变异(包括重复突变6种、缺失突变5种),其中5种仅见于肌萎缩侧索硬化症患者,提示拷贝数变异可能是肌萎缩侧索硬化症易感性的候选病因.

然而,染色体微阵列分析的适应症主要是精神运动发育迟缓、自闭症、多发性畸形等,且临床表型多样的阳性检出率远高于单一临床表型[33].除适应证外,该项技术还存在一定局限性,不能检出染色体平衡易位,不能检出点突变和重复突变等,因此,对于染色体微阵列分析呈阴性的患者还应行核型分析、原位荧光杂交或点突变和重复突变检测.

综上所述,对于临床医师而言,临床表型是首先获得的信息,临床表型和基因型异质性使致病基因的筛选变得复杂.对于某些特征性临床症状,能够直接指向某一具体疾病和基因,不建议进行大范围基因检测,而是首先选择单一基因检测;某种临床表型涉及的基因达数种、数十种甚至数百种,而已知致病基因的临床表型也有多种,可能存在未发现但与该基因相关的临床表型,建议选择目标区域捕获测序对相关基因进行筛查.在进行检测结果解读时,是否为致病性突变位点、基因突变是否与临床表型一致,临床医师不能依赖基因检测机构的结论,必须对临床表型和基因型的相关性具备一定识别能力,要有自己的判断.此外,尽管人类基因组遗传多态性和致病性突变数据库信息不断丰富,但关于许多罕见病的遗传学数据仍不完善,仍有许多突变位点的致病性尚不确定,二代基因测序技术检出基因突变及其位点较多,但其致病性信息不足,检测结果的判断不准确,可能使部分患者不能明确诊断.因此,基因诊断是一个临床信息和生物学信息不断沟通、不断更新的过程.

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Strategies and problems of genetic diagnosis for neurogenetic diseases

LI Xun⁃hua,CHEN Ding⁃bang,WU Chao
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat⁃sen University,Guangzhou 510080,Guangdong,China

LI Xun⁃hua(Email:lxh59xyh@sina.com)

Neurogenetic diseases are difficult to diagnose due to complicated phenotypes.Genetic testing is always the option for final diagnosis.With the progress and update of molecular diagnostic techniques,especially widely usage of next⁃generation sequencing(NGS),choosing proper sequencing methods is a new challenge. This paper aims to review different strategies and problems of genetic diagnosis for monogenic neurogenetic diseases based on clinical phenotypes,gene mutation characteristics and gene sequencing methodology.

Genetic diseases,inborn; Nervous system diseases; Genes; Review

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171070).

10.3969/j.issn.1672⁃6731.2017.07.002

国家自然科学基金资助项目(项目编号:81171070)

510080广州,中山大学附属第一医院神经科

李洵桦(Email:lxh59xyh@sina.com)

2017⁃05⁃26)