小潮气量高频机械通气对糖尿病模型小鼠肺损伤和炎症因子的影响

钱家树 林学正 卢光涛

小潮气量高频机械通气对糖尿病模型小鼠肺损伤和炎症因子的影响

钱家树 林学正 卢光涛

目的 观察小潮气量高频机械通气对糖尿病模型小鼠肺损伤和炎症因子的影响。方法成年雄性C57BL/6N小鼠40只，采用随机数字表法分为糖尿病+机械通气组（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸组（Dia-SB）、正常对照+机械通气组（Con-MV）和正常对照+自主呼吸组（Con-SB组），各10只。检测各组小鼠血浆肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。RT-PCR法检测各组小鼠肺组织匀浆TNF-α、IL-6和IL-10表达量。改良组织学评分系统评估肺损伤程度。结果 与治疗前相比，Dia-MV组血浆TNF-α、IL-6和IL-10水平随通气持续时间逐渐增加，而Con-SB组无显著变化。肺匀浆上述促炎细胞因子定量RT-PCR分析与血浆结果类似。Dia-MV组血浆SOD活性随着机械通气进行降低，MDA水平增加。肺匀浆SOD/MDA定量RT-PCR分析与血浆结果类似。与Con-SB组[（0.64±0.05）分]相比，Dia-MV组[（3.83±0.34）分，P＜0.05）]、Dia-SB组[（2.11±0.20）分，P＜0.05]、Con-MV[（1.98±0.18）分，P＜0.05]肺损伤评分增加。结论 小潮气量高频机械通气增加糖尿病模型小鼠肺损伤。

小鼠；糖尿病；机械通气；小潮气量；肺损伤；TNF-α；IL-6；IL-10

机械通气（mechanical ventilation，MV）是用于全身麻醉的必要的呼吸支持方法。不适当的通气，特别是高潮气量通气可导致肺损伤，其特征在于增加肺血管通透性和促使炎性介质的产生[1]。与传统的通气方法相比，小潮气量通气策略具有低潮气量和平台压力，能够降低机械通气过程中肺损伤发生几率[2]。近年来，越来越多的证据表明糖尿病与肺损伤密切相关[3-5]，在慢性高血糖状态下，细胞外基质沉积和肺纤维化，导致肺泡气体与血液交换障碍。糖尿病对小潮气量机械通气策略下肺功能的影响尚不清楚。本研究通过建立糖尿病动物模型，运用小潮气量高频率通气策略，检测炎症细胞因子肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）的表达和血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平，探讨小潮气量高频机械通气对糖尿病模型小鼠肺损伤的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物与分组 成年雄性C57BL/6N小鼠（50～60g）40只，来自温州医科大学动物实验中心，实验动物合格证号：SCXK-20120031。采用随机数字表法分为四组：糖尿病+机械通气组（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸组（Dia-SB）、正常对照+机械通气组（Con-MV）、正常对照+自主呼吸组（Con-SB组），各10只。本实验研究经温州医科大学附属第一医院动物伦理委员会批准。

1.2 糖尿病动物模型制作 C57BL/6N小鼠适应性饲养2天，糖尿病+机械通气组（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸组（Dia-SB）予脂类诱导饲料喂养4周后，予链脲佐菌素（STZ）溶于柠檬酸缓冲液（pH4.3，0.1mol/L）30mg/kg一次性腹腔注射，继续普通饲料喂养2周后禁食8h，按2g/kg灌服20%葡萄糖溶液，做口服糖耐量试验，0min和120min血糖分别＞7.0mmol/L和11.0mmol/L为造模成功[6]。

1.3 机械通气 使用动物呼吸机对Dia-MV和Con-MV组小鼠进行4h高频低潮气量机械通气，参数设置如下：潮气量8mL/kg，呼吸频率150次/分钟，吸气氧分数0.35。同时，将Dia-SB和Con-SB两组小鼠暴露于室内空气中自主呼吸4h。在实验过程中，使用多通道生理记录仪连续监测氧饱和度、血压和心率，并且输注林格氏溶液（8～10mL/h）以补充液体损失并将血压保持在正常范围内。实验开始后每小时从左颈动脉获得血液样品以分析血清参数，实验结束断头处死小鼠，取肺组织标本备用。

1.4 观察指标及方法 （1）采用双抗体夹心ELISA法检测血浆炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10水平，比色法检测超氧化物歧化酶（SOD）/丙二醛（MDA）水平。（2）RT-PCR法检测各组小鼠肺组织 TNF-α、IL-6和IL-10相对表达量。实验后取左肺组织100mg匀浆，采用Trizol试剂盒（上海生物工程技术有限公司）抽提总RNA，逆转录反应合成cDNA，然后采用PCR仪进行扩增，内参基因为GAPDH。目标基因是与内参GAPDH基因检测的引物（Invitrogen公司提供），序列为：Primer 1（Forward，5′→3′）；Primer 2（Reverse，5′→3′）GAPDH TGAAGGTCGGTGTGAAC GGATTTG GTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGTC；IL-6 GCACCCACTTCAAGCTCCA AAATTTGAAGGTGAGCATCCTG；IL-10 TGCCTTCAGCCAGGTGAAACTTT C CTTGATTTCTGGGCCATGCTTCTCTG；TNF-α AT ACCAACTATTGCTTCAGCTCCACAG GTACTGTGTG TCCAGGCTCCAAATAT；IL-1β GCACAGTATTGAAA GCCTAGAAAGTCGGTAGAAAGAGATAATCTGCTC TG。（3）肺组织病理学评估：中性粒细胞计数（PMN）、湿/干重比（W/D）和肺损伤评分。实验结束后取左肺部分肺叶，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，嵌入石蜡包埋，连续切片厚约4μm。HE染色，在光镜下观察肺组织病理学变化。肺损伤程度采用改良组织学评分系统[11]进行评估：①肺泡壁厚度；②炎性细胞浸润、聚集；③出血。每一项按以下五点进行分级：0为最小伤害，1为轻度损伤，2为中度损伤，3为重度损伤，4为最大损伤。肺损伤程度0～12分。中性粒细胞计数用来评估中性粒细胞浸润的程度，随机选择十个区域，计算每高倍视野肺泡（HPF，400×）的中性粒细胞数，取平均值。取右肺上叶样品进行称重，然后置60℃烤箱中，24h后再次称重，计算湿/干重比。

1.5 统计学方法 应用SPSS12.0软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间总体比较采用双因素方差分析，组间各时间点参数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆和肺组织匀浆炎症因子比较 机械通气前，Dia-MV组和Dia-SB组血浆TNF-α、IL-6和IL-10水平高于Con-MV组和Con-SB组，机械通气后，Dia-MV组上述指标高于其它三组（P＜0.05）。与治疗前相比，Dia-MV组血浆TNF-α、IL-6和IL-10水平随着通气持续时间逐渐增加，而Con-SB组无明显变化（图1A～C，插页）。肺匀浆中上述促炎细胞因子的定量RT-PCR分析显示与血浆结果类似（P＜0.05）（图2，插页）。

2.2 血浆和肺组织匀浆氧化应激参数比较 机械通气前，Dia-MV和Dia-SB组血浆 SOD活性低于Con-MV组和Con-SB组，而MDA水平则呈反向趋势。Dia-MV组血浆SOD活性随着机械通气进行降低，MDA 水平则增加（图 1D～E，插页）。Con-SB 组中未发现MDA水平和SOD活性的显著变化。肺匀浆SOD/MDA定量RT-PCR分析显示与血浆结果类似（P＜0.05）（图 2，插页）。

2.3 肺组织病理学改变及肺损伤评分 与Con-SB组[（0.64±0.05）分]相比，Dia-MV组[（3.83±0.34）分，P＜0.05]、Dia-SB组[（2.11±0.20）分，P＜0.05]、Con-MV[（1.98±0.18）分，P＜0.05]肺损伤评分增加（图3，插页）。Dia-MV组中的肺组织可见间质水肿，炎性细胞浸润，肺泡破裂出血，而在Dia-SB组或Con-MV组中仅发现轻微的肺微观结构变化。

3 讨论

本研究发现，糖尿病增加低潮气量高频通气小鼠肺损伤，可能与炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10增加和机体氧化应激平衡被打破有关。低潮气量（6mL/kg）和低平台压力保护性机械通气策略被证明可减少急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者肺损伤，降低死亡率[7-8]。本研究对象为小鼠，为了避免通气不足使用潮气量8mL/kg和频率150次/min行机械通气。

有证据表明DM与肺损伤密切相关，研究[9-11]认为，在慢性高血糖状态下，细胞外基质沉积和肺纤维化是糖尿病肺损伤病变的早期病理特征，但导致DM患者肺功能下降的主要原因是肺泡气体与血液交换障碍[12]。

本研究发现，随着机械通气时间增加，血浆炎性细胞因子和MDA显著增加，SOD水平降低，肺组织匀浆定量RT-PCR分析显示类似的结果。糖尿病小鼠机械通气4h后肺部可见间质水肿，炎性细胞浸润，肺泡破裂或出血，肺损伤评分显著高于其他组（P＜0.05），而非糖尿病小鼠对机械通气耐受性较好。这一结果与 Zarogoulidis 等[13]、Klein 等[14]和 Mirrakhimov[15]学者的调查结果相同，上述研究经过大样本的追踪调查发现，长期高血糖患者肺功能下降与炎症因子释放呈现中等强度的相关。另外的横向比较研究还发现，循环血液中血糖水平、炎症因子与未来发生肺功能下降的风险呈正相关[16]。

在糖尿病小鼠机械通气肺损伤发病过程中，除了上述高血糖引起的肺组织微结构性病变外，氧化应激平衡被打破也是重要原因之一[17]。在本研究中，随着机械通气时间延长，反应脂质过氧化的指标MDA水平增加，而抗氧化指标SOD则减少，可见糖尿病小鼠体内氧化应激平衡更容易被机械通气破坏。氧自由基是脂质过氧化的产物，与肺毛细管基底膜结合，从而损害肺毛细血管屏障通透性。在糖尿病影响下，除了葡萄糖可以自然氧化生成氧自由基外，NOS、NAD（P）H氧化酶和黄嘌呤氧化酶等多种活性物质也会导致氧自由基增加[18-20]。此外，线粒体呼吸链已被视为非酶生成氧自由基的另一个来源。糖尿病抑制了内源性抗氧化酶，包括谷胱甘肽、SOD、过氧化氢酶，从而影响活性氧的激活。

总之，低潮气量和高频保护性机械通气策略，仍能增加糖尿病模型小鼠炎症反应和相关肺损伤，其机制还有待于进一步研究。

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第五次世界中西医结合大会第三轮会议征文通知

世界中西医结合大会，每五年召开一次，已成功举办4次。第五次世界中西医结合大会将于2017年12月7日—10日在广州白云国际会议中心召开。本次大会的主题是“弘扬结合医学成果，服务人类健康”。大会由中国中西医结合学会主办，广东省中西医结合学会、广东药科大学承办，会议将全面展示近五年世界结合医学（包括中西医结合）的最新成果和研究进展，并邀请国内外著名专家学者进行精彩报告，通过相互交流和共同提高，促进医学创新。现将征文相关事宜通知如下：

1、征文内容（1）中西医结合理论研究，包括对结合医学学术地位与作用的认识，对新形势下发展结合医学的思路、途径和方法的理论探讨与经验总结等；（2）近五年来结合医学在临床研究、基础研究、药学研究、教学研究、学科建设、政策研究等方面取得的重要成果和宝贵经验；（3）结合医学各临床专业学科新诊疗经验的总结和分析，中西医结合新技术、新方法的推介与评价，以及实现科研成果向临床应用转化的新经验与新模式；（4）中西医结合优势病种临床诊疗路径的实践经验与临床共性问题的探讨，中西医结合标准化研究等；（5）结合医学的未来研究，以及其他促进结合医学发展的相关研究等。

2、征文要求（1）向本次大会所提交的论文应为未正式发表的论文。论文要求突出科学性、先进性、实用性、原创性，论据充分，对专业实践和行业管理具有一定的指导意义；（2）论文需提交中、英文摘要（800～1000字），欲了解更详细的论文格式要求，请登录世界中西医结合大会网站www.wimco2017.com；（3）投稿前请在投稿网站详细填写“新用户注册信息”，务必注明作者所属专业委员会（专业）、工作单位、职务职称、通讯地址、电子邮箱和手机号码等信息。

3、联系方式地址：北京市东直门内南小街16号 邮编：100700 电话：010-64093165 010-64025672 联系人：孔令青李亮平 赵蓬悦 010-59001126 13810810901

中国中西医结合学会

2017年7月19日

The ProtectiveMechanical Ventilation Strategy Based on Low Tidal Volumes and High FrequencyIncreases Lung Injury in Diabetes Mice

QIAN Jiashu,LIN Xuezheng,LU Guangtao.

Department of Anesthesiology,Taizhou Central Hospital(TaiZhou University Hospital),Taizhou(318000),China

ObjectiveTo investigate the effects of protective mechanical ventilation（MV） strategyon inflammation and lung injury in mice withdiabetes.MethodsForty C57BL/6N mice were randomly divided two groups:diabetic model was established in 20 mice and then subdivided into MVgroup（Dia+MV group）and spontaneous respiratory（SB） group（Dia+SB group）,with 10 mice in each;another 20 normal mice served as controls,which were also subdivided into Con+MV group and Con-SB group,with 10mice in each.Tumor necrosis factor-α（TNF-α）,interleukin-6（IL-6）,interleukin-10（IL-10）,superoxide dismutase（SOD） and malondialdehyde（MDA） levels in serum were detected and the expression of inflammatory cytokine mRNA was also determined in lung tissue.Lung damage was assessed using a modified lung injury score.ResultsCompared to baseline values,the serum levels of TNF-α,IL-6 and IL-10 were gradually increased over ventilation duration in Dia-MV group,while no similar results were observed in con-SB group.The activities of serum SOD decreased and MDA levels were conversely increased along with ventilation duration in Dia-MV group.Quantitative RT-PCR analysis of pro-inflammatory cytokines in lung homogenates presented similar results.The modified lung injury score was higher in Dia-MV group,Dia-SB group and Con-MV group as compared to that in Con-SB group（3.83±0.34,2.11±0.20,2.11±0.20 vs 0.64±0.05,P＜0.05）.ConclusionThe protectivemechanical ventilation strategy based on low tidal volumes and high frequency increased the inflammation reaction and associated lung injury in diabetic mice.

mice;diabetes;mechanical ventilation;low tidal volume;lung injury;TNF-α;IL-6;IL-10

浙江省台州市中心医院（台州学院附属医院）麻醉科（台州318000）

钱家树，Email：2793913132@qq.com；Tel：13906631675

（收稿：2017-04-20 修回：2017-06-10）