结核病诊断中酶联免疫斑点试验检测试剂临床应用的风险评估与控制

杨蕾 卢锦标 都伟欣 王国治 陈保文



·专论·

结核病诊断中酶联免疫斑点试验检测试剂临床应用的风险评估与控制

杨蕾 卢锦标 都伟欣 王国治 陈保文

通过对可能影响γ干扰素释放试验(IGRA)的酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测结果的受试者、检测方法、环境设施和仪器等因素的风险识别与分析，提示ELISPOT检测试剂在临床结核病诊断应用中可能产生的风险，并提出相应的风险控制措施，以降低该类试剂的检测风险。

结核； 干扰素γ； 酶联免疫斑点检测； 危险性评估； 质量控制

结核分枝杆菌感染人体后激发的免疫反应以诱导分泌γ干扰素的辅助T淋巴细胞(TH)1型免疫为主。γ干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)的酶联免疫斑点试验(ELISPOT)试剂以特异性抗原做为刺激源，体外激发特异性T细胞分泌γ干扰素，再利用固相ELISPOT 检测分泌γ干扰素细胞的数量，以此来判断是否感染了结核分枝杆菌。目前，已有大量研究显示该试剂检测活动性结核病有较高的诊断敏感度和特异度[1-3]。与结核菌素纯蛋白衍生物试验(purified protein derivative test，PPD试验)皮内诊断试剂相比，ELISPOT检测结核感染不受卡介苗接种的影响[4-5]，具有较高的敏感度和特异度，但诊断结核病的稳定性存疑[6]。

笔者对可能影响临床检测结果的受试者、检测方法、环境设施及检测仪器等因素进行了风险识别与分析，提示ELISPOT检测试剂临床研究与临床检测时可能产生的风险，并提出了相应的风险控制措施，为ELISPOT检测试剂的临床应用、临床研究方案的制定、临床研究过程的监督评估以及临床研究结束后研究结果的分析提供参考。

一、受试者影响因素风险管理

(一)抗结核药物治疗及治疗时间对ELISPOT检测结果的影响与控制

大量文献报道，结核病患者经抗结核药物治疗后特异性斑点数减少，有些试验结果显示检测阳性率降低。刘红等[7]报道：结核病患者在应用抗结核药物治疗前与治疗后[2～4周]分别进行结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测，治疗前抗原A(早期分泌靶抗原6，ESAT-6)和抗原B(培养滤液蛋白10，CFP-10)的特异性斑点平均数分别为99个和49个，治疗后平均数分别为47个和18个，治疗后斑点数明显少于治疗前斑点数，差异均有统计学意义(t=5.211，3.383；P值均<0.01)。Park和Tae[8]在韩国的一项研究显示，活动性结核病患者经一线抗结核药物治疗前与治疗后第1个周末，以及完成疗程后分别进行T-SPOT. TB检测，结果表明：33例患者治疗前及治疗后第1个周末检测有31例呈阳性，2例呈阴性；完成疗程后，31例检测阳性患者中有28例呈阳性，其中3例阴转，但2例检测阴性患者全部转阳；另一方面，治疗后抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)的特异性斑点平均数较治疗前下降明显(下降数量分别为27个和24个)，差异有统计学意义(P<0.05)。Yan等[9]的研究发现，正在接受抗结核药物治疗的活动性结核病患者的T-SPOT.TB检测阳性率(65.17%，58/89)明显低于未接受治疗的患者(80.62%，208/258)(P=0.003)；并且，治疗的时间越长，检测阳性率也越低(P=0.010)。Li等[10]对儿童结核病的研究也有类似的结果，检测抗结核药物治疗1周以上的患者假阴性率(57.31%)高于治疗1周及1周以内或未治疗组的患者(18.3%)(P=0.035)。这些结果提示抗结核药物治疗1周以上会降低酶联反应斑点数，进而影响检测结果。

在我国，ELISPOT试剂已被批准用于结核病辅助诊断[11]，而鉴于结核病患者经治疗后检测斑点数可能降低，进而影响诊断结果，因此，临床使用可能仅作为结核病疗效观察和诊断性治疗观察的指标之一[8-9]。但是，在试剂的临床试验中，若将不同治疗时间的患者均入组为结核病患者组，极有可能导致检测阳性率比实际结果偏低。

可以应对的风险控制措施：(1)建议在临床试验时，选择初治且还未治疗的患者、初治且治疗1周内的患者(可能不会干扰诊断结果，但可能使临床结果偏离)、1个月内病原学检查阳性的患者入组。(2)临床研究的结果分析可按不同实验对象分级评价试剂敏感度，分别进行菌阳患者、菌阴患者和结核病患者(菌阳与菌阴)的阳性率分析。

(二)菌阳、菌阴结核病患者的比例对研究结果的影响与控制

1.ELISPOT试剂对菌阳患者的检测效能：本试剂主要用于结核病辅助诊断，患者中应包括菌阳与菌阴患者，但ELISPOT试剂对二者的检测敏感度有可能不同。Yan等[9]采用T-SPOT. TB试剂对涂阳、涂阴、培阳、培阴患者的检测阳性率分别为85.71%(84/98)、14.29%(14/98)、73.66%(73/107)、26.34%(34/107)。吴妍等[12]使用T-SPOT.TB试剂检测了346例老年肺结核患者，菌阳、菌阴患者检测阳性率分别为90.32%、72.09%。王新宁等[13]使用T-SPOT.TB试剂和分枝杆菌改良罗氏固体培养法检测了214例结核病患者，其中菌阳患者109例、菌阴患者105例，检测结果显示： ELISPOT检测菌阳和菌阴患者的阳性率分别为89.0%(97/109)、18.1%(19/105)。以上结果均提示 ELISPOT试剂对菌阳患者的检测敏感度较高。

2. ELISPOT试剂的其他临床应用：ELISPOT试剂临床试验招募的人群理论上应尽可能与试剂未来使用人群相似，但不同级别的医院患者的来源与背景不同，菌阴菌阳患者的比例也不一样。一般来说，基层医院就诊的大多数为初诊患者，菌阳患者比例较低；大型专科医院经基层医院诊断后再就诊的患者较多，菌阳患者比例较高；而综合性医院非典型症状的结核病患者和其他疾病需要排除结核病的患者较多。另外，由于ELISPOT试剂对不明原因发热的患者检测阳性率较低[14]，对恶性肿瘤患者检测的特异性也较低[5,15]，需特别注意。

可以应对的风险控制措施：(1)考虑到 ELISPOT试剂对菌阳与菌阴患者的检测敏感度有可能不同，且病原学检测呈阴性并不能排除结核分枝杆菌感染，故建议在进行临床总结分析时，应参考体外诊断制剂的敏感度分析方式，分别计算菌阳患者和菌阴患者的阳性率，以及所有结核病患者的总阳性检出率，分析其在不同人群中的敏感度。(2)不同医院结核病患者菌阳与菌阴患者比例不同，各医院不宜制定统一比例，建议参考《结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂注册技术审查指导原则》[16]中“涂片阴性的肺结核患者占所有肺结核患者的比例应不小于50%”的基本要求，在总的研究结果中应有一定比例的菌阴结核病患者数量，范围控制在(45±10) %为宜。

(三)菌阴肺结核患者对研究结果的影响与控制

多数研究报告的结果显示，ELISPOT试剂对菌阳患者的检出率高于菌阴患者[2-3,17]；但也存在不同的研究报告。依据刘红等[7]的报道，该院T-SPOT.TB检测确诊结核病患者、菌阴患者的阳性率分别为77.8%和87.6%，后者阳性率明显高于前者。李晋等[18]采用酶联免疫斑点法检测无痰或痰涂片阴性的结核病患者密切接触者，阳性率为41.9%(18/43)；检测痰涂片为“+++”的结核病患者密切接触者，阳性率为31.5%(23/73)。这两项研究中ELISPOT检测阳性率均高于金标准，提示临床医师采用ELISPOT试剂辅助诊断菌阴结核病时，有将结核感染者误诊为结核病患者的可能。

可以应对的风险控制措施：由于在临床试验总结中，常以某种诊断性试剂作为阳性对照，使得阳性对照试剂计算所得的阳性检出率一般会高于其他试剂。并且，我国目前仅批准ELISPOT试剂用于结核病辅助诊断。所以，在临床评价时，不应单纯以同类试剂作对照，建议增加其他检测方法作为评价参考；应避免在确诊前进行试剂盒的评价分析，尤其是菌阴结核病患者。并建议在检测标准程序操作(SOP)中，规定各项检测的报告时间与报告方式，以避免检测结果干扰临床医师的判断，造成误诊和评价不准确。

(四) 免疫抑制剂使用患者对检测结果的可能影响与控制

研究表明，在IGRA检测免疫抑制剂使用患者时，ELISPOT法受免疫抑制状态的影响较小，其检测敏感度明显高于ELISA法，以下研究均可证实ELISPOT检测在免疫抑制剂使用患者的结核病诊断中有较高的价值[1，11，19-21]；但在患者机体处于严重免疫抑制状态时，如人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者、慢性免疫介导的炎症性疾病患者、免疫系统未发育完全的儿童和器官移植患者等，T细胞反应被严重抑制，ELISPOT检测可能会出现假阴性[2，19-21]。一项Meta分析表明[22]，在中低收入国家，T-SPOT.TB检测严重免疫抑制状态的HIV感染者时阳性率明显降低。祁燕伟等[23]的研究表明，CD4+T淋巴细胞水平对T-SPOT.TB阳性率有一定影响，在CD4+T淋巴细胞计数≤50个/μl的HIV感染者中敏感度降低，且患者在IGRA检测前经免疫抑制剂治疗很可能会降低其检测敏感度[19]。Edwards等[24]的研究发现，皮质类固醇和抗TNF-α治疗使得30%的患者检测结果由阳转阴，测得的IFN-γ浓度明显降低。另一项Meta分析结果表明[25]，对免疫抑制剂治疗的患者(如类固醇、口服免疫抑制剂和生物治疗等)的检测，对ELISPOT结果有负面效果。这些研究发现，免疫抑制剂的存在降低了ELISPOT的阳性检出率，提示ELISPOT在检测这类患者时可能存在风险。

可以应对的风险控制措施：(1)抗逆转录病毒治疗可以使HIV感染者的免疫功能得以恢复，建议HIV感染者ELISPOT检测结果呈阴性时，可以在抗逆转录病毒治疗后且CD4+T淋巴细胞计数超过200个/μl时复查 ELISPOT[21]。(2)对于拟进行器官移植和慢性免疫介导的炎性疾病患者，应在免疫抑制剂治疗前进行ELISPOT检测[1,21]。(3)临床研究时对免疫抑制剂使用患者，尤其是5岁以下儿童，可同时使用皮内诊断试剂检测[1,11,21]。该建议考虑了两点：其一是美国FDA的指南和美国儿科学会均推荐在5岁以下的儿童中优先使用TST检测，说明该试剂检测有一定的意义。其二是在临床总结中将TST检测作为同型对照实验，能更直观的反映ELISPOT的敏感度和特异度，有利于对检测结果作进一步的解释；并在研究结果中增加对免疫抑制剂使用患者的敏感度和特异度的分析，再结合同型对照试剂的检测结果和临床确诊结果进行评价。

二、实验方法影响因素的风险管理

1. 细胞计数方式(人工、仪器)的影响：ELISPOT检测细胞计数可在细胞染色后人工计数或仪器计数。人工计数时，由于显微镜观察的视野为平面而细胞是立体的，有时难以确定细胞状态导致计数结果不准确；当细胞分离状态不好有碎片时，也可能会影响计数的准确性；若加样前未充分混匀，细胞沉积会导致计数结果偏低，影响检测效果。仪器计数较人工计数相对准确，但若细胞浓度过高或过低时，计数结果准确性也会降低；当样本检测结果位于灰区(细胞浓度过高)时，可能会导致假阳性，而细胞浓度过低时，也可能会导致假阴性。

2.斑点判读方式的影响：ELISPOT检测斑点数的判读方式可分为人工和仪器两种。人工判读是使用放大镜放大图像，肉眼观察斑点进行判读。仪器判读是扫描斑点图后根据设置自动判读，再人工复核。由于仪器判读时放大倍数较大，斑点图像更清晰，判读更准确，尤其是灰区样本，人工判读和仪器判读结果可能会有偏差。

3.加样后混匀方式的影响：ELISPOT检测加样操作分别为加入刺激物和淋巴细胞并将之混合均匀，有几种操作方式：(1)应轻拍或轻晃加样板，但也有样本污染的风险，严重时甚至导致相邻的样本混合：(2)用移液枪尖吸打，但枪尖尖锐，反复吸打可能造成细胞损伤，降低细胞活力，甚至导致细胞死亡；(3)使用96孔板恒温震荡仪混匀样液时需注意转速，转速过高可能会造成细胞损伤。

可以应对的风险控制措施：(1)建议在检测开展前，尤其是大规模的临床研究，应提前进行实验条件的优化，在SOP中需限定采用同品牌同型号仪器，并设定同一参数检测。(2)若无细胞计数或斑点计数仪器，可采用双人独立完成再对比复核的方式计数。

三、环境设施和仪器等影响因素的风险管理

1.ELISPOT试剂的储存与运输：ELISPOT试剂需要低温存放。若试剂在储存和运输过程中，冰箱或冷链车辆的制冷装置出现故障，环境温度过高可造成试剂长时间暴露在高温中，或温度过低导致试剂冻结，或试剂取出后放置室温时间过长等，这些非正常因素均可能影响试剂的检测结果。

可以应对的风险控制措施：(1)试剂储放冰箱和冷链车辆宜有自动记录与自动报警装置，运输时应备有应急车辆；(2)应制定仪器或装置的故障应急程序，该程序应明确在何种情况下试剂不再使用或经何种验证后方可恢复使用；(3)操作SOP时，应明确试剂取出后在室温下操作的时长，在实验原始记录中应能体现，以便在结果异常时可溯源分析。

2.其他因素的风险管理：(1)ELISPOT检测外周血单个核细胞的提取和培养均需洁净环境，若超净工作台、CO2培养箱或洁净室清洁度不够，可能导致污染的发生，影响检测结果。(2)若在细胞培养时，CO2培养箱发生故障致温度异常，或CO2气体耗尽但又无法补充，均可能导致细胞生长异常，影响检测结果。(3)ELISPOT试剂检测时还需试验人员自备淋巴细胞分离液(Ficoll)。它是分离外周血淋巴细胞的关键试剂，若质量好则细胞回收率高，质量不好则细胞回收率低，可能会影响检测结果的可靠性[5]。

可以应对的风险控制措施：(1)承担临床试验和临床检测的操作人员应进行专门的实验和仪器操作规范培训；实验操作、仪器维护和人员进出均严格按照细胞实验室操作规范进行。(2)在开展临床试验前应对洁净室和仪器进行维护保养和清洁处理，确认洁净室和仪器处于正常状态。(3)试剂采购前经预实验确认性能应符合规定，采购后均按规定放置，且需注意有效期。(4)CO2培养箱宜有自动记录与自动报警装置，在资金允许的情况下最好购置备用仪器以应对紧急情况。

四、小结

受试者的病原学状态，抗结核药物治疗进程和是否使用免疫抑制剂等是ELISPOT试剂使用的关键性风险点。环境设施、仪器耗材和检测方法涉及到试剂的储存运输、实验操作和质量控制，也可能影响到ELISPOT试剂的检测结果。临床检测和临床研究时，应针对这些风险点，采取相应的风险控制措施，保证结果的可靠性和准确性。

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(本文编辑：孟莉 薛爱华)

Risk assessment and control of interferon-γ release enzyme-linked immunospot assay in its clinical applications for TB detection

YANGLei,LUJin-biao,DUWei-xin,WANGGuo-zhi,CHENBao-wen.

DivisionofTnberculosisVaccins,NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China

CHENBao-wen,Email:bwchen@126.com

In order to reduce the risk of the interferon-γ enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay when it is used for detection of patients with tuberculosis (TB) in clinical trial or clinical diagnosis, we did a risk assessment through risk identification and analysis to the factors that may affect the test results, such as the subjects who received ELISPOT test, the test methods, environmental facilities and instruments, etc. and then we put forward the corresponding risk control measures.

Tuberculosis; Interferon-gamma; Enzyme-linked immunospot assay; Risk assessment; Quality control

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.020

100050 北京，中国食品药品检定研究院结核病疫苗室

陈保文，Email：bwchen@126.com

2017-03-03)