掌握科学规律是实施科学防治的前提——分子流行病学技术在结核病防治中的应用

贺文从 刘东鑫 赵雁林



·述评·

掌握科学规律是实施科学防治的前提
——分子流行病学技术在结核病防治中的应用

贺文从 刘东鑫 赵雁林

科学防治结核病的重中之重是了解其分布特征和影响因素，通过掌握其传播规律、耐药机制及有效实施科学决策下的结核病控制策略和措施，从而达到控制结核病的目的。然而由于结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染、耐药产生等因素，传统的流行病学方法不能很好地揭示其传播流行规律。结核分子流行病学以基因分型技术为基础，将传统流行病学与新兴的生物技术相结合，从分子水平来阐明结核病的发生、发展、流行、耐药产生及传播规律。分子流行病学在结核病暴发流行的调查、近期传播的追踪、菌株多样性的研究、内源性复燃和外源性再感染的区分、耐药机制及传播等研究中的优势显著[1]，为制订有效的结核病控制策略提供了理论基础。

目前，应用于MTB研究的分子流行病学方法主要有以下5种：(1)基于MTB散在分布重复单位-数目可变串联重复序列的分型方法(MIRU-VNTR)；(2)间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)；(3)插入序列6110(IS6110)限制性片段长度多态性分型方法(IS6110-RFLP)；(4)单核苷酸多态性分型技术(SNP)；(5)全基因组测序(WGS)技术。现将各种方法的原理、优缺点及应用阐述如下，以扩大分子流行病学方法在结核病防治方面的应用。

一、MIRU-VNTR分型方法

MTB染色体中存在很多包含分枝杆菌重复单位(MIRUs)的位点，每一位点包括1～12个首尾相连的完全相同或者有轻微差别的重复序列。MIRU-VNTR分型方法是对多个相互独立的MIRU位点进行PCR扩增，然后PCR产物和MIRU marker同时跑电泳，根据电泳图与marker的比较，判断每个位点的拷贝数，从而为每一株菌建立一组由多个数字组成的MIRU“身份证号码”。此方法在辨别IS6110拷贝数很低(<6个)的分离株时非常有效，且分辨率要高于IS6110-RFLP和Spoligotyping单独分型[2]，随着MIRU-VNTR基因分型所用重复序列的增多，分型能力也逐渐增强。目前，国际上应用较多的分辨率最高的3种VNTR位点组合是最早的第12位点，欧洲的第15位点和美国推荐的第24位点。李墨等[3]曾对72株北京地区分离的北京基因型MTB菌株的24个VNTR位点进行分析，证明不同VNTR位点组合(第12位点、第15位点、第24位点)在北京基因型菌株中的分辨指数依次升高，分别为0.788、0.990、0.992。由于第15位点的分辨指数与第24位点的分辨指数基本相同，我国主要采用基础的VNTR15位点作为MTB分子流行病学研究的一线方法[4-5]。

MIRU分型基于PCR，实验操作较为简单、分辨率高、所需的DNA量较少、结果可重复性好，且数字化的结果易于实验室间的比较。随着基因分析仪器的使用，MIRU分型能够自动化，更加简便快速，可以对大量MTB菌株进行分型，最重要的是可以区分混合感染。MIRU-VNTR分型方法是目前最有吸引力的MTB分型方法，并且应用也最广泛。但VNTR分型方法本身具有非同源相似性的缺陷，对于特定的位点组合，不同种系的菌株可能有相同的型别，因此先利用SNP和长序列多态性(LSP)进行谱系定义，再用VNTR进行分型是目前MTB基因分型的一种高效策略。

二、Spoligotyping分型方法

Spoligotyping分型方法是根据特异存在于MTB复合群的且具有多态性的直接重复(direct repeat，DR)区而构建的，通过比较各菌株的DR区，以发现间隔区和DR 区的(染色体)中间缺失和(或)插入。该方法针对目前发现的多种不同的间隔序列，设计各自特异的寡核苷酸探针，并将探针固定在尼龙膜上，引物预先用生物素等标记，扩增产物与膜上的探针进行反向杂交，然后通过增强化学发光试剂盒进行检测。由于不同菌株的间隔序列不同，最终各自杂交的探针数量和种类也会不同。目前，Spoligotyping主要根据43个位于直接重复区域中间隔序列的存在与缺失对菌株进行分子分型。Spoligotyping 分型商业化试剂盒较多，只需几个小时就可以完成，并且可以与数据库SploDB4及SITVIT-WEB国际多位点遗传标志物数据库中的数据进行对比，非常简单快速，而且重复性高。Spoligotyping是经典的MTB分型方法，该技术最大的优点是可以对MTB进一步分型到亚种水平，对含有IS6110拷贝数较少的菌株分辨率较高，可以进一步鉴定IS6110-RFLP分型不能鉴定的菌株，但是该方法单独使用时分辨能力较低，Liu等[6]对1585株菌进行分析，Spoligotyping的Hunter-Gaston分辨率指数(HGDI)为0.399，对北京家族菌株分辨率更低，当与MIRU-VNTR分型方法联合使用时分辨率高达99.89%。

Spoligotyping方法鉴定北京家族菌株快速、简单、操作可重复性高，但分辨率较低，尤其不能区分不同的北京基因型菌株，且不能识别复合感染。目前多与IS6110-RFLP或MIRU-VNTR联合使用，并且这种组合已在世界各个国家广泛使用[7-8]。

三、IS6110-RFLP分型方法

IS6110是MTB基因中最常见的IS序列，是一段自然发生的转座序列，属于IS3家族，也是目前研究比较清楚的IS序列。不同菌株中，IS6110的拷贝数变化很大，从0个到超过25个，这种差别是利用IS6110进行菌型鉴定的基础。根据MTB基因组中存在插入序列IS6110的数目及位置不同，利用限制性内切酶PvuⅡ来切割IS6110上相应位点进行消化，经过电泳分离，可以得到类似指纹样的特征性条带，这些条带称为IS6110-RFLP DNA指纹。IS6110-RFLP方法是一种经典的MTB分型方法，使用广泛并且分辨率高。印度Mathuria与Anupurba[9]曾利用IS6110-RFLP方法对26株MTB分离株进行分析，发现26株菌中2株(7.8%)为0拷贝，3株(11.5%)为低拷贝，21株(80.8%)为多拷贝，表现出多种型别，这说明对于印度分离株，IS6110-RFLP仍然是一种有前途的分型方法并且拥有较高的分辨率。而Liébana等[10]对339株MTB进行IS6110-RFLP分析，高达35株未见IS6110序列PCR条谱，使鉴定难以进行，这说明应用IS6110-RFLP进行分型，实验结果差异较大。

虽然IS6110-RFLP方法具有较高的分辨率并且特异性较强，但是自身的局限性也较大，如不适用拷贝过低或者过高菌株的分型、需要的样本量多、操作复杂、实验结果差异性较大、重复性差等，这些都限制了这种经典分型方法的发展，随着其他分型方法的发展，IS6110-RFLP在MTB分子分型中的应用会越来越少。

四、SNP 分析技术

SNP主要是指基因组水平上由于单个核苷酸变异引起的基因组DNA序列多态性，包括碱基的转换、颠换、插入和缺失。SNP的鉴定方法主要分为两大类：一类是测序相关方法，主要包括全基因组测序和目的片段测序；另一类是基于PCR扩增的非DNA测序方法，如实时定量PCR和基因芯片等。利用各种技术确定的SNP被广泛应用于菌种鉴定、药物敏感性试验、菌株分型及进化分析和流行病学检测等。MTB耐药性的产生多由基因的突变导致，耐药性相关基因的SNP检测已经成为MTB药物敏感性试验的重要手段[11]，如MTB对异烟肼耐药相关的SNP主要发生在katG、inhA等基因中。有研究表明，katG基因SNP在对异烟肼耐药菌株中的发生率达到30%～60%；另外rpoB密码子的SNP与MTB对利福平高水平的耐药有关[12]。Chauhan等[13]研究发现，牛分枝杆菌和卡介苗(BCG)中narK2X基因启动子区域有1个SNP突变，通过检测这个SNP可快速、准确地将MTB与MTB复合群(包括牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌等)区分开。北京家族菌株被认为具有更高的毒力和侵袭力，Homolka等[14]研究认为Rv2629等位基因中A191C突变是北京基因型的生物学标志；Alonso等[15]利用该标志建立了一种与RT-PCR结合的高分辨率熔解实验，可快速区分北京家族与非北京家族的菌株。许多研究认为，MTB基因组SNP可被用来进行进化分析，特别是其中的同义SNP，由于研究认为其不受选择压力的影响，故被认为是进行MTB进化分析的理想生物学标志[16-17]。

就目前的研究现状来说，基因测序的成本较高，且为保证SNP的高分辨率和代表性需要选择较多的位点，因此该分型方法对于少量的菌株或者初步分型还是比较实际的。如果对于大量菌株全部进行SNP分型，因为位点太多，测序成本太高，数据处理复杂，不利于推广使用。但SNP可以克服VNTR同源异性的内在缺陷，Luo等[18]采用8个SNP位点结合VNTR-15的复合分型方法在一定程度上证明了该论点，同时也说明2种或2种以上分型方法的联合使用可以达到较为满意的结果。但有研究证明，SNP分型技术的分辨率并不高，在用于追踪传染源和查找传播途径等菌株水平的传统基因分型研究方面较为困难[19]。从严格意义上来说，SNP是基因组水平上另一种多态性的展示，并不适合用于基因分型研究，但用于耐药产生和传播是最好的方法，而在基因分型方法的应用方面，该方法可作为补充。Shah等[20]于2011—2014年期间在南非夸祖鲁-纳塔尔省通过连续、动态纳入所有在该省常住的新诊断为广泛耐药结核病的患者，并对其社会人口学信息、MTB和HIV感染史、密切接触者线索调查(全球定位系统ArcGIS软件)，对所有患者的临床分离株进行RFLP分析和耐药相关基因(rpoB、katG、inhA、pncA、gyrA、rpsL、rrs和gidB)测序；对于RFLP差别少于1个，耐药相关基因序列完全相同的定义为一个簇，认为其是由于传播造成的；而对于不能成簇或者具有独特基因型的菌株认为其耐药性的产生是获得性耐药。该研究清楚地揭示了在南非夸祖鲁-纳塔尔省，30%的XDR-TB患者是由于传播造成，由此认为在该地区造成XDR-TB流行的主要因素可能是传播，而不是传统认为的不恰当治疗引起。该研究所应用的分子流行病学方法学具有标杆性的作用，特别是在耐药性产生及传播方面。

SNP检测方法的建立为快速、高效的耐药性检测提供了可能，也为MTB的进化研究提供了支持，随着测序成本的降低及各种技术的推广，我们相信对MTB基因组SNP的研究会不断地深入，该技术一定会在结核病、尤其是耐药结核病的防控与治疗方面提供越来越多的帮助。

五、WGS技术

WGS技术能够全面、精确地分析基因组的碱基序列，从而破解其所包含的信息，揭示基因组的复杂性、多样性。随着测序技术的飞速发展，WGS技术已广泛应用于科研、医疗和分子流行病学的研究中。在结核病防治方面的应用主要体现在4个方面：(1)通过测序获得MTB全基因组序列信息并进行菌种鉴定。Zhou等[21]利用测序得到的基因组序列进行核苷酸等长区域(1000～10 000 bp)划分，每个区域随机核苷酸字符串(k，1

WGS技术可以快速全面地获得菌株的全基因组信息，能够在基因水平上揭示细菌在传播过程中的遗传变异，准确判断传播方向，是系统进化研究的金标准。随着测序技术不断进步，成本不断下降，WGS将会全面应用于MTB的流行病学监测，这将对了解MTB的分子进化、基因组成、基因调控、耐药传播等具有重要意义。但是该项技术成本较高，并且需要特定的技术和软件，这些都限制了WGS的广泛应用。

六、分子流行病学在结核病防治中应用的展望

由于实验室条件的限制，目前我国基层实验室还未能全面开展MTB分子流行病学研究，致使学者对我国结核病的传播规律、分布形式及耐药特征未能有全面的了解。MTB分型手段日趋丰富，分型过程越来越简单、快速、高效。各种分型技术或者分子生物学方法将会应用到日常的结核病监测中，MTB种系关系会逐渐被阐明，菌株生物学表型与基因型的关系越来越受到关注。运用高分辨率的分型方法可更好地将菌株不同的遗传背景与其不同的毒力和致病力联系起来，研究特有基因型菌株的致病性和传播特征、高致病性菌株的种系发生和分布特征，了解耐药结核病的产生及传播，这些对于结核病的防控和治疗有着巨大意义。目前，MIRU-VNTR分型的辨识能力与IS6110-RFLP分型技术相当，但较IS6110-RFLP分型技术的操作简单，并且MIRU-VNTR分析已经自动化。未来一段时间内，我国乃至世界上MTB的分型会以MIRU-VNTR分型技术为主。

随着二代测序技术的普及和三代测序技术的逐步完善，测序有望实现低成本和高效率兼得。未来SNP技术及WGS技术将会全面应用到对MTB的监测及耐药结核病产生及传播的研究中。从片面的基因分型跨入全基因组研究过程中，人类对MTB的耐药、致病机制和传播规律会有更深的认识。

作为世界上最大的发展中国家，我国的结核病及耐药结核病防治形势都面临严峻挑战，结核病耐药率较高，而耐多药肺结核致死率高，治愈率低。Zhao等[23]研究表明，我国结核病患者中总的MDR-TB 发生率为8.32%， XDR-TB 发生率为0.68%。提示我们需要进一步加强我国结核病患者，尤其是MDR-TB患者的管理。引入分子流行病学技术，可以确定我国主要流行性菌株的型别，并且可以做好筛查工作，早期筛查出结核病患者、特别是MDR-TB患者，从而给予患者及早的隔离和治疗。分子流行病学将在研究结核病易感性、疾病传播的发生与传播、感染与发病的潜伏期之间的关系、内源性复发与外源性再燃的比例、不同菌株是否有不同的病理表现、不同菌株的传播模式及对抗结核药敏感性的差异、混合感染出现的频率、不同人群中发病的危险因素、监测实验室检测错误的发生等方面，在预防医学与基础医学、乃至大数据分析公共卫生事件等领域发挥重要作用。未来分子流行病学技术也将广泛应用于我国结核病的防治，对于改善我国结核病及耐药肺结核的高发现状将有重大帮助。

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(本文编辑：薛爱华)

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.001

102206 北京，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所(贺文从、刘东鑫)，结核病预防控制中心(赵雁林)

赵雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2017-07-18)