NF-κB 表达与糖尿病大鼠肺损伤的关系

韩雪 姜晓艳 刘悦



NF-κB 表达与糖尿病大鼠肺损伤的关系

韩雪 姜晓艳 刘悦

目的探讨糖尿病大鼠肺脏的NF-κB表达情况及NF-κB的表达增强对肺脏损伤的程度。方法30只10周龄SD大鼠随机分为正常对照组(A 组，雌雄各5只)、糖尿病模型组(B组，雌雄各10只)，采用链脲菌素诱导建立12周糖尿病大鼠模型。模型建立12周后，全部大鼠采用20%的乌拉坦1.35 g/kg 腹腔内注射麻醉处死，并取左肺下叶固定切片。光学显微镜下观察肺组织炎症程度，免疫组织化学方法检测肺组织NF-κB表达的阳性面积百分比。结果①肺部炎症观察：大多数正常对照组大鼠肺组织内未见炎症细胞。糖尿病模型组可见片状炎症细胞聚集，局部肺泡结构消失；②NF-κB的表达: NF-κB主要表达于气管、肺泡的上皮细胞内。正常对照组肺组织阳性表达明显弱于糖尿病模型组。分别对正常对照组和糖尿病模型组大鼠肺脏支气管上皮细胞和肺泡壁上皮细胞的NF-κB的表达做秩和检验(P<0.05)具有明显统计学差异。结论2型糖尿病大鼠模型肺组织内时炎症的改变程度较正常对照组相比明显加重，NF-κB的表达增加可能是糖尿病时肺脏病变的一个重要的危险因素。

2型糖尿病； 肺损伤； 核因子κB

糖尿病是一种以糖脂代谢紊乱为特征的疾病，其病理生理过程可累及多个器官，近年研究显示，糖尿病时可引起不同程度的肺脏损伤，这与糖尿病引起的机体免疫能功能降低、氧化应激损伤、微血管病变以及自主神经病变有着密切的关系[1]。2型糖尿病是一种与免疫相关的慢性炎症性疾病。当免疫细胞累及胰岛细胞时，会导致胰岛β细胞减少，胰岛素分泌失调,同时糖尿病患者的高血糖症导致氧化应激及炎症反应[2]。而糖尿病的氧化应激，与肺脏中的活化SOD减少，自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)活性和CD4+/CD8+下降，NF-κB活化等有关。但是糖尿病是否导致了肺脏中的NF-κB的表达增加仍没有相关报道。早在20世纪70年代Schuyler等[3]就首次提出肺脏可能是糖尿病的靶器官之一。本实验旨在通过检测糖尿病大鼠肺脏内的NF-κB的表达情况来研究NF-κB与糖尿病肺损伤的关系。

材料与方法

一、实验材料

30只成年SD大鼠(雌雄各15只)随机分为正常对照组(A 组，雌雄各5 只)、糖尿病模型组(B组，雌雄各10 只)。 糖尿病造模成功后饲养12周后20%乌拉坦1.35 g/kg腹腔内注射麻醉处死大鼠均取肺左下叶, 放入4%多聚甲醛标本固定2 h。常规脱水、浸蜡、包埋、制蜡块、切片厚度5～6 μm。光镜下观察。

二、测定方法与评价指标

1. 判定炎症程度: 光镜下观察在HE染色切片上，阅读整张切片，根据炎症细胞的多少(主要观察淋巴细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞)进行定级。(-)： 肺间质无炎性细胞出现或散在少量炎症细胞；(+)： 肺间质有较多的炎性细胞浸润，在气管、血管周围可见炎症细胞呈小灶性聚集；(+++)：炎性细胞密集，成片状分布，炎性细胞聚集处肺泡结构消失；(++)： 炎性细胞浸润程度介于(+)与(+++)之间。

2. NF-κB表达水平测定：免疫组化采用SP法测定组织内的NF-κB的表达水平，于高倍镜(×200) 下，每个标本观察5张切片，每张切片上随机选取10个视野，分别统计每个视野中NF-κB阳性着色面积并记录，(-)：表示无表达；(±)：表示表达面积小于5%；(+)：表示表达面积在5%～30%之间；(++)：表示表达面积在30%～50%之间；(+++)：表示表达面积在50%～75%之间；(++++)：表示表达面积大于75%。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学处理。等级资料采用秩和检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、大鼠饲养情况

饲养过程中，糖尿病组3只雄性大鼠死亡，其他大鼠均正常进入试验。

二、糖尿病组与正常对照组在光镜下肺部炎症程度比较

正常对照组10只大鼠中，9只大鼠炎症程度为(-)；1只大鼠炎症程度为(+)。而在糖尿病组17只大鼠中，2只大鼠炎症程度为(+)；12只大鼠炎症程度为(++)；3只大鼠炎症程度为(+++)。糖尿病组炎症病变明显高于正常对照组，差异有统计学意义，P<0.05。

三、糖尿病组与正常对照组NF-κB在支气管壁上皮细胞表达比较

正常对照组10只大鼠中，5只大鼠NF-κB在支气管壁上皮细胞表达程度为(±)；5只大鼠NF-κB在支气管壁上皮细胞表达程度为(+)。而在糖尿病组17只大鼠中，11只大鼠NF-κB在支气管壁上皮细胞表达程度为(+++)；6只大鼠NF-κB在支气管壁上皮细胞表达程度为(++++)。NF-κB在糖尿病组支气管壁上皮细胞表达阳性率明显高于正常对照组，P<0.05。

四、糖尿病组与正常对照组NF-κB在肺泡壁上皮细胞表达比较

正常对照组10只大鼠中，5只大鼠NF-κB在肺泡壁上皮细胞表达程度为(±)；5只大鼠NF-κB在肺泡壁上皮细胞表达程度为(+)。而在糖尿病组17只大鼠中，11只大鼠NF-κB在肺泡壁上皮细胞表达程度为(+++)；6只大鼠NF-κB在肺泡壁上皮细胞表达程度为(++++)。NF-κB在糖尿病组肺泡壁上皮细胞表达阳性率明显高于正常对照组，P<0.05。

讨 论

近年研究显示，糖尿病引起的肺脏损伤，主要与糖尿病时的氧化应激、NF-κB的活化等有关。但以NF-κB作为靶点预防和治疗糖尿病肺损伤的相关报道较少。为探讨NF-κB表达增强与糖尿病肺损伤的关系。本实验通过检测NF-κB的表达来判定糖尿病对肺的损伤。

NF-κB即核转录因子，是1986年由美国麻省理院癌症研究中心的Bltimore和麻省Whitehead生物医学研究所的Rwiansen发现的成[4]，NF-κB是广泛存在于各种细胞胞浆内的核转录因子，它通常以二聚体的形式与NF-κB 抑制蛋白( inhibitor kappa B，IκB)结合而呈无活性状态[5]。它可被多种刺激因子激活，与IκB 解离后进入到细胞核内，调控多种基因的转录，参与感染、炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤等病理过程。

大量的研究显示在肺部炎症时可以发现NF-κB在上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞内表达增强。糖尿病时，由于患者血糖升高，糖化血红蛋白生成增多，氧合血红蛋白减少，红细胞携氧能力下降，加之血糖升高致血液粘稠度升高，微血管灌注不良，均可致组织细胞缺氧，促进自由基形成，导致炎症的形成[6]。同时糖尿病肺损伤患者的氧化应激导致肺泡上皮的损伤,增加中性粒细胞游走及转录因子的活动,包括转变成肿瘤坏死因子α(TNF-α), 白介素8(IL-8)及其他炎症介质的k基因结合NF-κB。NF-κB增加体内一氧化氮(NO)的水平，而NO是形成活性氧(ROS)的底物[7]，从而可降低肺的抗氧化能力导致肺脏损伤。

Poyneter等[8]对气道上皮细胞内NF-κB活化被特异性抑制的转基因小鼠进行研究，发现这种小鼠在脂多糖刺激后，其肺部的中性粒细胞浸润，中性粒细胞趋化因子和炎症因子显著减少，这提示气道上皮细胞内NF-κB活化可能参与了抗原诱导的炎症和之后的免疫反应。Fakhrzadeh等[9]在p50基因敲除小鼠的实验中，发现野生型小鼠肺泡巨噬细胞内NF-κB活性在接触臭氧后迅速升高，并且到达高峰，而基因敲除小鼠的这个反应被大大的缓解。研究提示肺部巨噬细胞内NF-κB活化是肺部炎症形成的重要原因之一 。还有实验表明，高血糖引起的NF-κB激活的结果是增加巨噬细胞的浸润以及增加促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的释放[10]。

本实验证实，2型糖尿病大鼠肺脏内的炎症程度明显重于正常对照组，肺脏支气管壁上皮细胞、肺泡壁上皮细胞的NF-κB的表达明显增强。所以糖尿病肺部疾病的发生中NF-κB的活化是一个重要的危险因素。因此，在糖尿病患者的肺脏中抑制NF-κB的激活,可减少肺部炎症反应和氧化应激,并最终缓解糖尿病肺损伤[11]。通过抑制胞浆中 NF-κB活化、抑制其在的核内转位、抑制其在核内与DNA的结合等途径来防止NF-κB的活化从而达到预防和治疗糖尿病肺脏病变的目的。临床上可以选用对NF-κB的活化有抑制作用的药物来缓解糖尿病肺损伤。

胰岛素除了通过降低高血糖间接地对抗炎症外还可以通过抑制炎症因子的产生, 增加抗炎因子的合成。Dandona等[12]在人体试验中发现输注胰岛素能在数小时内产生快速抗炎作用, 包括诱导NO释放, 增加内皮细胞NO合酶表达, 抑制NF-κB等炎症相关因子和活性氧的浓度；影响一氧化碳合酶的产生从而抑制NF-κB的活化。内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 主要分布在神经元和内皮细胞, 其活性稳定, 能持续小量催化NO生成, 具有神经介质和调节局部血流作用；诱导型一氧化氮合酶静息时缺乏或浓度很低, 只在病理情况下才大量表达, 能催化生成大量NO, 从而导致内皮细胞功能紊乱、血管过度扩张、组织损伤。目前研究认为, eNOS增加是众多疾病发病的关键。Langouche等[13]给ICU病房的危重患者输注胰岛素强化控制血糖的一组对比研究结果表明, 胰岛素的输注能明显抑制eNOS过度表达而显著改善预后。Dandona等[14]研究发现, 特异的一氧化氮合酶抑制剂能够阻断胰岛素对ICAM21的抑制作用, 故认为NF-κB水平的降低与一氧化氮的释放增加有关。除了胰岛素外，还有研究报道，使用改善循环的药物对炎症时毛细血管的通透性具有强有力的减轻作用，并且使炎症的渗出减少，从而有效促进炎症的吸收[15]。 也有研究报道，连翘酯苷A可使肺组织中的NF-kB表达明显下调，从而减轻炎症反应[16]。大黄素可破坏脂伐结构、抑制NO 的生成、抑制NF-κB 的活化，从而下调TNF-α、IL-1β、ICAM-1、CINC-1、ELAM-1、MMP-2，MMP-9 等炎症因子水平，从而发挥抗炎作用[17]。

本实验证实2型糖尿病大鼠肺脏内的炎症程度明显重于正常对照组，这与肺脏支气管壁上皮细胞、肺泡壁上皮细胞的NF-κB的表达明显增强有关。所以糖尿病肺部疾病的发生中NF-κB的活化是一个重要的危险因素。临床上可以通过抑制NF-κB的表达来预防和治疗糖尿病肺损伤。

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(本文编辑：王亚南)

韩雪，姜晓艳，刘悦. NF-κB 表达与糖尿病大鼠肺损伤的关系[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(3)： 309-312.

The relationship between expression of NF-κB and injury of lung of the diabetic rats

HanXue,JiangXiaoyan,Liuyue.

Thefirstclinicalhospital,Harbinmedicaluniversity,Harbin150001,China

JiangXiaoyan,Email:Jiangxy1963@126.com

Objective To detect the expression of NF-κB in the detection of diabetic rat lungs to study whether diabetes can lead to enhanced expression of NF-κB in the lungs resulting in lung injury of varying degrees. Methods 30 cases of 10 weeks old SD rats were randomly divided into normal control group (group A, male and female 5), diabetic model group (B group, male and female 10) with streptozotocin induced by 12 weeks diabetic rat model. Model after 12 weeks, all rats were 20% urethane 1.35 g/kg intraperitoneal injection of anesthesia were sacrificed, and were taken to the left lower lobe. The percentage of positive area of lung tissue inflammation in the degree of immunohistochemical method for detection of lung tissue NF-κB expression was observed under an optical microscope. Results ① lung inflammation observed: no inflammatory cells in the lung tissue of most of the normal control rats. Diabetic model group visible sheet inflammatory cell aggregation, the local alveolar structure disappeared; ②of NF-κB expression: NF-κB was mainly expressed in the trachea, alveolar epithelial cells, the epithelial cells of the vascular wall and expression but significantly weaker than the expression on the former two. Positive expression of normal lung tissue of the control group was significantly weaker than the DM group. Respectively rank sum test (P<0.05) with significant difference between the expression of the normal control group and diabetic model rats lung bronchial epithelial cells and alveolar wall epithelial cells, NF-κB. Conclusions NF-κB expression in type 2 diabetic rat model of lung tissue significantly increased while inflammation of the degree of change compared with control group was significantly heavier, so we have come to the conclusion of type 2 diabetes so that the lungs of rats with NF-κB expression increased, the increase in the expression of NF-κB has become an important risk factor for lung lesions of varying degrees of diabetes.

Type 2 diabetes mellitus; Lung injury; NF-κB

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.014

黑龙江省教育厅基金资助项目(1253199)

150001 哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第一临床医院

姜晓艳， Email: Jiangxy1963@126.com

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2016-05-08)