A-FABP基因表达与拜城油鸡公鸡肌内脂肪的相关性研究

邵勇钢，李凤鸣，王旭光，王彦钦

(新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

A-FABP基因表达与拜城油鸡公鸡肌内脂肪的相关性研究

邵勇钢，李凤鸣，王旭光，王彦钦

(新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

[目的]研究拜城油鸡公鸡A-FABP基因的表达与肌内脂肪含量之间的相关性。[方法]随机选取拜城油鸡公鸡90只，随机分为3组，每组30只。采用索氏抽提法和荧光定量PCR方法分别在12、18和24周龄测定胸肌和腿肌中肌内脂肪含量和A-FABP基因的相对表达量。[结果]随着周龄的增长，肌内脂肪含量显著增加，相同周龄拜城油鸡公鸡腿肌中肌内脂肪含量极显著高于胸肌中肌内脂肪含量(P<0.01)。不同周龄间、胸肌和腿肌间A-FABP基因的相对表达量差异不显著(P>0.05)。[结论]拜城油鸡公鸡A-FABP基因的表达水平与肌内脂肪含量没有显著相关。

拜城油鸡；A-FABP基因；基因表达；肌内脂肪

拜城油鸡是新疆阿克苏地区拜城县特有的地方优良品种，有人认为，该鸡种在秋季育肥后胸部迅速沉积大量脂肪，所以被称为油鸡；也有人认为，该鸡种皮肤和肌肉间有一层散发出特殊香味的很薄的脂肪层，所以被称为油鸡[1]；此外，还有人认为该鸡种全身皮下脂肪分布均匀，在禽类中较为特别，因此称为油鸡[2]。肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)含量是影响鸡肉肉质和风味的重要因素之一。研究表明，拜城油鸡胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量极显著高于地方土鸡[3]，拜城油鸡鸡肉中不饱和脂肪酸比例显著高于市售肉鸡[4]，这可能是形成拜城油鸡优良风味的重要原因之一。脂肪型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte fatty acid binding protein，A-FABP)是一种与细胞内的脂肪酸转运与代谢密切相关的蛋白[5]。Wang等[6]研究表明编码该蛋白的A-FABP基因的表达与肌内脂肪含量存在相关性。笔者利用荧光定量PCR技术检测不同生长发育阶段拜城油鸡公鸡A-FABP基因的相对表达量，并结合肌内脂肪含量的测定结果，分析二者之间的相关性，旨在为进一步深入研究A-FABP基因影响肌内脂肪含量的作用机理及拜城油鸡的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 试验随机选取健康拜城油鸡公鸡90只，随机分为3组，分别在12(性成熟前)、18(性成熟)、24(上市)周龄分批屠宰，每批拜城油鸡公鸡屠宰采样测定各30只。屠宰后迅速剥开胸部和腿部的皮肤，分别采取胸肌和腿肌组织放入预先装入RNA保存液的无RNA酶的冻存管中(样品与RNA保存液的体积比约为1∶10)，于4 ℃冰箱中平衡过夜后，置于-80 ℃超低温冰箱中保存。采取完整的左侧胸肌和腿肌放入自封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存。

依据GB/T 9695.7—2008，采用索氏抽提法测定胸肌和腿肌中粗脂肪的百分含量，以肌肉中的粗脂肪占鲜样中的百分比表示。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂。RNA样品储存液(北京汇天东方科技有限公司)、RNA提取试剂盒(Qiagen公司)、无RNA酶的DNA酶试剂盒(Qiagen公司)、反转录酶试剂盒(Promega公司)、Oligo(dT)18引物(Takara公司)、超纯dNTP mix(Takara公司)、RNA酶抑制剂(Takara公司)、荧光定量试剂盒(Takara公司)。

1.2.2 主要仪器。Retsch MM400球磨仪(德国)、Eppendorf Centrifuge 5810R 低温高速离心机(德国)、NanoDrop ND-1000分光光度计(美国)、Eppendorf Mastercycler gradient 梯度PCR仪(德国)、DYCZ-24F型电泳槽(北京市六一仪器厂)、DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)、CFX96TMReal-time system荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)。

1.3 胸肌和腿肌中RNA的提取 使用Retsch MM400球磨仪分别进行拜城油鸡公鸡胸肌和腿肌肌肉组织匀浆，采用Qiagen公司RNeasy Mini Kit试剂盒提取胸肌和腿肌鸡肉组织中的RNA，采用Qiagen公司的无RNA酶的DNA酶试剂盒去除提取的RNA中可能存在的基因组DNA，纯化RNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并检测RNA浓度。将提取的RNA置于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.4 反转录 采用20 μL反转录体系：每管加入1 μg RNA模板，2 μL Oligo(dT)18(50 pmol/μL)，加无RNA酶的灭菌超纯水至总体积5 μL，70 ℃ 5 min，4 ℃快速制冷，冰浴5 min。然后，每管中加入无RNA酶的灭菌超纯水6.1 μL，反转录酶缓冲液4 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.4 μL，超纯dNTP mix (10 mmol/L)1 μL，RNA酶抑制剂(40 U/μL)0.5 μL，ImProm-ⅡTMReverse Transcriptase 1 μL。RT-PCR反应程序为25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，快速冷却至4 ℃。将获得的cDNA在-20 ℃冰箱中保存。

1.5 引物设计 参考鸡的A-FABP(Fatty acid binding protein 4，adipocyte)基因的mRNA序列(登录号为NM_204290.1)跨内含子设计引物，内参持家基因β-actin基因的引物设计参考Zhang等[7]的方法。引物信息具体见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 荧光定量PCR引物

1.6 荧光定量PCR 荧光定量PCR反应体系(20 μL)为：SYBR Premix ExTaqTM10 μL，上、下游引物各1 μL(4 μmol/L)，ddH2O 7 μL，cDNA模板1 μL。整个反应在Bio-Rad CFX96TMReal-time system荧光定量PCR仪中进行，采用两步法，荧光定量PCR反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s。荧光定量PCR结束后，绘制熔解曲线。

1.7 数据统计与分析 采用2-ΔΔCt法计算待测基因的相对表达量[8]，以胸肌作为对照。试验数据均用平均值±标准误

表示。采用SPSS 18.0统计软件对相同周龄胸肌和腿肌间的肌内脂肪含量及A-FABP基因的相对表达量进行t检验；采用单因素方差分析对不同周龄间胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量及A-FABP基因的相对表达量进行分析，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 胸肌和腿肌中RNA的提取结果 从图1可以看出，提取的胸肌和腿肌中的RNA条带清晰完整，可用于进一步试验。

注：M.Marker；1～10.RNA样品。 Note：M.Marker；1-10.RNA samples.图1 RNA提取检测结果 Fig.1 The detection results of extracted RNA

2.2 肌内脂肪含量与A-FABP基因表达量的测定结果 由表2可知，随着周龄的增长，拜城油鸡公鸡胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量逐渐增加，18周龄和24周龄胸肌中的肌内脂肪含量极显著高于12周龄胸肌中的肌内脂肪含量(P<0.01)，18周龄和24周龄胸肌中的肌内脂肪含量差异不显著(P>0.05)；不同周龄腿肌中的肌内脂肪含量从高到低依次为24、18、12周龄，差异极显著(P<0.01)；相同周龄的拜城油鸡公鸡腿肌中的肌内脂肪含量极显著高于胸肌中的肌内脂肪含量(P<0.01)。不同周龄的拜城油鸡公鸡胸肌和腿肌中的A-FABP基因的相对表达量之间差异不显著(P>0.05)。

表2 肌内脂肪含量与A-FABP基因相对表达量

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；*表示与相同周龄的胸肌肌内脂肪含量相比差异显著(P<0.05)；**表示与相同周龄的胸肌肌内脂肪含量相比差异极显著(P<0.01)。

Note：Different small letters in the same column indicated significant difference(P<0.05)；Different capital letters in the same column indicated extremely significant difference(P<0.01)；*indicated significant difference with intramuscular fat content in breast muscle of male chicken with the same week-age(P<0.05)；**indicated extremely significant difference with intramuscular fat content in breast muscle of male chicken with the same week-age(P<0.01).

3 讨论

李文娟等[9]分别在56、90、120日龄对北京油鸡、矮脚鸡、白来航鸡和AA肉鸡胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量进行测定，结果表明肌内脂肪含量随着日龄的增长而增加，腿肌肌内脂肪含量显著高于胸肌肌内脂肪含量，存在显著的品种效应；在清远麻鸡中，120日龄胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量显著高于56日龄[10]；在56日龄和120日龄的鹿苑鸡和如皋鸡中胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量随日龄的增加而显著增加，鹿苑鸡胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量显著高于如皋鸡，存在品种差异[11]。该试验结果与前人研究结果一致，肌内脂肪含量随日龄增加而增加，胸肌中的肌内脂肪含量显著低于腿肌中的肌内脂肪含量，说明肌内脂肪的沉积在不同品种、不同生长发育阶段和不同部位之间存在差异。12周龄如皋鸡胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量显著高于安卡红鸡，存在品种差异，但同一品种内胸肌和腿肌中的肌内脂肪含量差异不显著[12]，这与该试验结果不同，推测可能是由于受到品种和采样时间等因素的影响所致。

研究表明，在不同鸡种的胸肌和腿肌中未能检测到A-FABP基因的表达，A-FABP基因主要在腹脂和肝脏中表达[10-11]。据报道，在不同年龄和不同鸡种中A-FABP基因表达量随着日龄的增长而增加，存在显著的性别差异[9]；在北京油鸡中，A-FABP基因表达量随周龄的增长而增加，8周龄与13周龄间无显著差异，17周龄显著增加，存在品种和性别差异[13]；如皋鸡A-FABP基因的表达不存在性别差异，胸肌中A-FABP基因表达量在2周龄较低，4周龄最高，6周龄至12周龄缓慢降低[14]；在和田黑鸡腿肌中A-FABP基因表达量显著高于三黄鸡，在和田黑鸡和三黄鸡中A-FABP基因的相对表达量与肌内脂肪含量呈显著正相关[6]；也有研究认为，A-FABP基因表达水平与肌内脂肪含量之间没有显著的相关性[9，11]。该研究结果表明，在不同周龄的拜城油鸡公鸡胸肌和腿肌中A-FABP基因的相对表达量未检测到显著差异，推测A-FABP基因的表达受到不同品种、不同性别、不同年龄和不同组织等因素的影响，在拜城油鸡公鸡中肌内脂肪含量和A-FABP基因的相对表达量间可能没有显著的相关性。

在东北农业大学肉鸡高脂系公鸡中，腹脂中A-FABP基因的表达量显著低于低脂系公鸡腹脂中的表达量，推测A-FABP基因表达量对脂肪沉积影响的机理可能是该基因的高表达量水平导致脂解率增加，从而导致腹脂减少[15]。Navidshad等[16]和Shi等[17]研究表明A-FABP基因有可能通过影响PPARγ基因的表达进而影响脂肪细胞的增殖与分化。在拜城油鸡中A-FABP基因的表达对肌内脂肪沉积的影响，还有待于进一步研究。

4 结论

随着拜城油鸡公鸡周龄的增长，肌内脂肪含量显著增加，相同周龄胸肌中的肌内脂肪含量极显著低于腿肌中的肌内脂肪含量，胸肌和腿肌中A-FABP基因的相对表达量在不同时期未检测到显著差异，推测在拜城油鸡公鸡中A-FABP基因的表达水平可能与肌内脂肪含量没有显著相关。

[1] 格明古丽，许宗运，吾买尔江·艾孜木，等.新疆拜城油鸡[J].中国家禽，2003，25(1)：35-36.

[2] 钟元伦，钟玲，尹家振.新疆“拜城油鸡”的选育效果[J].新疆畜牧业，2008(1)：28-30.

[3] 阿曼古丽·依马木山，热娜古丽·木沙，方勇，等.拜城油鸡和地方土鸡脂质成分比较分析研究[J].新疆农业科学，2014，51(3)：552-557.

[4] 热娜古丽·木沙，阿曼古丽·依马木山，方勇，等.拜城油鸡鸡肉及鸡皮脂肪酸组成分析研究[J].食品研究与开发，2016，37(13)：104-108.

[5] SHI H，WANG Q G，WANG Y X，et al.Adipocyte fatty acid-binding protein：An important gene related to lipid metabolism in chicken adipocytes[J].Comp Biochem & Physiol.Part B Biochem Mol Biol，2010，157(4)：357-363.

[6] WANG Y，CHEN H W，HAN D G，et al.Correlation of the A-FABP gene polymorphism and mRNA expression with intramuscular fat content in Three-Yellow Chicken and Hetian-Black Chicken[J].Anim Biotechnol，2016，27(4)：1-7.

[7] ZHANG G X，TANG Y，ZHANG T，et al.Expression profiles and association analysis with growth traits of theMyoGandMyf5 genes in the Jinghai yellow chicken[J].Mol Biol Rep，2014，41(11)：7331-7338.

[8] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2ΔΔCt method[J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[9] 李文娟，李宏宾，文杰，等.鸡H-FABP和A-FABP基因表达与肌内脂肪含量相关研究[J].畜牧兽医学报，2006，37(5)：417-423.

[10] 屠云洁，苏一军，王克华，等.清远麻鸡H-FABP和A-FABP基因mRNA的差异表达研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，38(4)：53-58.

[11] TU Y J，SU Y J，WANG K H，et al.Gene expression of heart and adipocyte fatty acid-binding protein in chickens by FQ-RT-PCR[J].Asian-Australas J Anim Sci，2010，23(8)：987-992.

[12] 屠云洁，苏一军，王克华，等.利用实时荧光定量RT-PCR检测鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达[J].中国畜牧杂志，2010，46(7)：1-4.

[13] LI W J，LI H B，CHEN J L，et al.Gene expression of heart-and adipocyte-fatty acid-binding protein and correlation with intramuscular fat in Chinese chickens[J].Anim Biotechnol，2008，19(3)：189-193.

[14] 常国斌，周琼，栾德琴，等.鸡A-FABP基因不同基因型遗传效应及初步验证[J].畜牧兽医学报，2011，42(8)：1088-1094.

[15] SHI H，WANG Q，ZHANG Q，et al.Tissue expression characterization of chicken adipocyte fatty acid-binding protein and its expression difference between fat and lean birds in abdominal fat tissue[J].Poult Sci，2010，89(2)：197-202.

[16] NAVIDSHAD B，ROYAN M.Ligands and regulatory modes of peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)in avians[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2015，25(4)：287-292.

[17] SHI H，ZHANG Q，WANG Y，et al.Chicken adipocyte fatty acid-binding protein knockdown affects expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ gene during oleate-induced adipocyte differentiation[J].Poult Sci，2011，90(5)：1037-1044.

Study on the Correlation between the Expression ofA-FABPGene and Intramuscular Fat in Male Baicheng Fatty Chicken

SHAO Yong-gang, LI Feng-ming, WANG Xu-guang et al

(College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi, Xinjiang 830052)

[Objective] To study the correlation between the expression ofA-FABPgene and intramuscular fat in male Baicheng Fatty Chicken. [Method] Ninety male Baicheng Fatty Chicken were randomly selected and divided into three groups. There were thirty chicken in each group. The content of intramuscular fat in breast muscle and leg muscle of male chicken and the relative expression level ofA-FABPgene were determined by using Soxhlet extraction method and fluorescence quantitative PCR. [Result] The content of intramuscular fat significantly increased with the prolonging of week-age. The content of intramuscular fat in leg muscle was significantly higher than that in breast muscle at the same week-age (P<0.01). The relative expression level ofA-FABPgene had no significant difference between the breast muscle and leg muscle, among different week-ages (P>0.05). [Conclusion] The relative expression level ofA-FABPgene in male Baicheng Fatty Chicken might have no significant correlation with the content of intramuscular fat.

Baicheng Fatty Chicken;A-FABPgene; Gene expression; Intramuscular fat

国家自然科学基金项目(31260550)。

邵勇钢(1974- )，男，新疆乌鲁木齐人，副教授，博士，从事动物遗传育种研究。

2016-11-01

S 879.2

A

0517-6611(2016)34-0147-03