芒柄花素对人表皮共培养体黑素合成的影响

陈志伟，汪洋，叶藤，许洁，陈信春，周翘楚，杜晓靖

（1．浙江省温州市中西医结合医院，温州325000；2．安徽中医药大学，合肥330012）

·论著·

芒柄花素对人表皮共培养体黑素合成的影响

陈志伟1，汪洋1，叶藤1，许洁1，陈信春2，周翘楚1，杜晓靖1

（1．浙江省温州市中西医结合医院，温州325000；2．安徽中医药大学，合肥330012）

目的观察芒柄花素对人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系模型（人表皮共培养体）中酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。方法建立人表皮共培养体，建成后分别加入30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L芒柄花素，熊果苷为阳性对照组，测定芒柄花素和熊果苷对人表皮共培养体中酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响。结果芒柄花素3种浓度对人表皮共培养体中酪氨酸酶活性及黑素合成与对照组比较均有明显抑制作用（P＜0．05），且浓度越高抑制作用越明显（P＜0．05）。高、中浓度芒柄花素黑素抑制率高于熊果苷（P＜0．05）。结论芒柄花素对黑素合成有明显抑制作用，机理与其对酪氨酸酶活性有抑制作用相关。

芒柄花素；人表皮共培养体；酪氨酸酶，黑素

皮肤的黑素主要由位于表皮基底层黑素细胞产生，皮肤颜色的深浅是由黑素含量的多少及其分布决定。酪氨酸酶是皮肤黑素合成的主要限速酶，其活性与黑素合成含量呈正相关。因而影响黑素细胞和酪氨酸酶生物活性的药物可以用于色素障碍性皮肤病的治疗[1]。芒柄花素又名刺芒柄花素，是黄酮类植物激素的一种，具有调节体内血脂代谢、抑制过敏性炎症等作用[2－3]，本研究在人表皮共培养体中检测芒柄花素对酪氨酸酶活性及黑素的影响。

1材料与方法

1.1 材料 芒柄花素、254黑素细胞培养基（M254）、人黑素细胞生长添加剂2（HMGS－2）、牛垂体提取物、角质形成细胞培养基（K－SFM）、人角质形成细胞生长添加剂（HKGS），表皮生长因子购自Cascade公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、DMEM、EDTA、胰酶均购自Gibco公司；左旋多巴（L－DOPA）均购自Sigma公司；L－谷氨酰胺购自上海生工生物工程技术有限公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物有限公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 取材来源 本院外科6～20岁正常男性常规包皮环切术后的包皮，知情同意。

1.2.2 人表皮共培养体[4]①原代黑素细胞和角质形成细胞培养：取包皮环切术后的包皮，去除皮下组织后分割成1 cm×1 cm左右的小块，胰酶4℃消化过夜；分离表真皮，吹打成细胞悬液，离心后计数，以（4～6）×106/mL的密度接种于直径25 mL培养瓶中，培养基为MC254完全培养基。24 h后换液，1周后传代。角质形成细胞的培养步骤同上，只是它使用的是角质形成细胞完全培养基。取3代的细胞用于实验。②黑素细胞和角质形成细胞共同培养：将黑素细胞接种于已有角质形成细胞的培养板中，两者接种比例为1∶2，其所用培养基为黑素细胞与角质形成细胞完全培养基1∶2混合而得。

1.2.3 实验分组 设加入3种浓度芒柄花素为实验组1（30 mg/L）、实验组2（60 mg/L）、实验组3（120 mg/L），加入熊果苷为阳性对照组[5]（20 mg/L），单纯细胞培养基为空白对照组。

1.2.4 MTT实验 首先将角质形成细胞种植于96孔板，24 h后再接种黑素细胞，待细胞贴壁后加入相应药物建立实验组1、实验组2、实验组3，阳性对照组及空白对照组，每组设5个复孔。继续培养72 h后，弃上清，每孔加入5 mg/L的MTT溶液20 μL，放入37℃、5%CO2孵箱4 h，弃上清，每孔加DMSO 150 mL，室温振荡10 min后置酶标仪490 nm波长下测量各孔吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.5 酪氨酸酶活性测定 按照Kazuhisas等[6]方法将共培养细胞按1×104/孔接种于96孔板，建立实验组1、实验组2、实验组3，阳性对照组及空白对照组，另设培养基组为只加培养基，不加细胞，在490 nm波长下测量各孔吸光度值（A）。酪氨酸酶活性抑制率=[（A对照组－A实验组）/（A对照组－A培养基组）]×100%。

1.2.6 黑素含量测定实验[7]将共培养细胞接种于6孔培养板，37℃、5%CO2中孵育24 h，弃上清液，建立实验组1、实验组2、实验组3，阳性对照组及空白对照组。培养48 h后用0．25%胰酶消化收集细胞，镜下计数。得到的细胞悬液1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL NaOH，在80℃水浴保温2 h后于490 nm酶标仪测吸光度值。黑素含量抑制率= [1－（实验组吸光度/细胞数的平均值）/（空白对照组吸光度/细胞数的平均值）]×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13．0统计软件分析，组间方差分析，2组间比较t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验 结果显示3种浓度芒柄花素及熊果苷对人表皮共培养体中细胞活力均无明显影响。

2.2 芒柄花素对酪氨酸酶活性的影响 结果表明3种浓度芒柄花素对人表皮共培养体中酪氨酸酶活性呈剂量依赖性抑制作用，实验组间比较差异有显著性（t12=32．12，P＜0．05，t23=4．76，P＜0．05），与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0．05）。熊果苷对酪氨酸活性无明显影响（P＞0．05）。见表1。

表1 芒柄花素对人表皮共培养体酪氨酸酶活性和黑素的影响 （s，%）

表1 芒柄花素对人表皮共培养体酪氨酸酶活性和黑素的影响 （s，%）

注：设空白对照组抑制率为0，与对照组比较，芒柄花素各组对酪氨酸酶活性和黑素合成抑制率均有统计学意义，*P＜0．05，#P＜0．05。熊果苷对酪氨酸酶活性与对照组比较无显著抑制P＜0．05。

组别（浓度mg/L） 酪氨酸酶活性抑制率 黑素抑制率芒柄花素 （030） 30．03±4．41* 32．95±1．92#（060） 47．73±3．61* 52．37±1．48#（120） 51．65±3．91* 57．50±1．73#熊果苷 （020） 0．04±0．13 46．64±1．46空白对照组 0* 0#

2.3 芒柄花素黑素含量的影响 结果表明3种浓度芒柄花素对人表皮共培养体中黑素含量呈剂量依赖性抑制作用，实验组间比较差异有统计学意义（t12=93．93，P＜0．05，t23=9．23，P＜0．05），与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0．05），高、中浓度芒柄花素对黑素含量的抑制率高于熊果苷（P＜0．05）。

3 讨论

随着细胞培养技术不断提高，体外黑素细胞与角质形成细胞共培养体系不断完善，人表皮共培养体越来越接近人体内黑素实际沉着的过程，故其用于筛选药物对黑素沉着的影响更接近于临床。沙苑子为笔者临床治疗黄褐斑的效方[8]—消斑美肤汤的主要药物，黄酮类又是沙苑子中的主要成分之一，具有抗肝损伤、调节血脂、降压、抑制血小板聚集、提高免疫功能、抗炎、抗氧化、清除自由基、抗衰老、及抗肿瘤等作用[9－10]。芒柄花素为沙苑子黄酮的主要成分，故笔者采用其3种浓度（30 mg/L、60 mg/L，120 mg/L）及熊果苷在人表皮共培养体中进行实验，检测其对酪氨酸酶活性以及黑素的影响，研究芒柄花素对黑素影响的机理及适宜浓度。结果表明芒柄花素在不影响细胞活力的3种浓度下对人表皮共培养体中酪氨酸酶活性以及黑素合成的抑制均呈剂量依赖性抑制作用，高、中浓度对黑素生成的抑制率优于20 mg/L熊果苷，提示其抑制黑素生成机理与其抑制酪氨酸酶活性相关。同时本研究的结果显示芒柄花素抑制黑素的作用强于抑制酪氨酸酶的作用，故笔者认为芒柄花素还有其他途径抑制黑素的生成，其机制还有待进一步研究。

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Effects of the Formonone on Melanin Biosynthesis in Human Epidermal Co-culture System

Chen Zhiwei1,Wang Yang1,Ye Teng1,Xu Jie1,Chen Xinchun2,Zhou Qiaochu1,Du Xiaojing1
1.Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China;
2.Anhui Univercity of Tradisional Chinese Medicine in Anhui Province,Hefei 330012,China;

ObjectiveIn order to observe the effects of the formonone on tyrosinase and melanin in the model of pigment of human epidermal cells combined with malpighian cell co－culture system(human epidermal co－culture system)．MethodsEstablished the human epidermal co－culture system，added the formonone at three concentrations(30 μg/mL，60 μg/mL，120 μg/mL)into this system．Added the arbutin into this system as the control group．The effects of the formononetin and arbutin on tyrosinase activity and melanin pigment in the human epidermal co－culture system were observed．ResultsCompared to the control group，formononetin at three concentrations had obviously inhibitory effects on tyrosinase activity and melanin pigment in the human epidermal co－culture system (P＜0．05);and the higher concentrations，the more obvious inhibition effects(P＜0．05)．At high and middle concentrations，the formononetin had more inhibitory rate than arbutin(P＜0．05)．ConclusionThe formononetin has obvious inhibitory action on melanogenesis．The mechanism may be correlated with inhibitting the activity of tyrosinase．

Formonone;Human epidermal co－culture system;Tyrosinase;Melanin pigment

R739.5

A

1672－0709（2016）05－0261－02

2015－08－18）

浙江省中医药科技计划；项目编号：2013ZA121

汪洋，E－mail：5486842@163．com