雷公藤多苷对变应性接触性皮炎患者干扰素诱导蛋白10及其受体表达的影响

李艳华，许建，于腾

（1．山东省济宁市传染病医院，济宁 272000；2．山东省济宁市疾病预防控制中心，济宁 272000；3．山东省济宁市第一人民医院，济宁 272000）

·论著·

雷公藤多苷对变应性接触性皮炎患者干扰素诱导蛋白10及其受体表达的影响

李艳华1，许建2，于腾3

（1．山东省济宁市传染病医院，济宁 272000；2．山东省济宁市疾病预防控制中心，济宁 272000；3．山东省济宁市第一人民医院，济宁 272000）

目的观察雷公藤多苷对变应性接触性皮炎患者（Allergic contact dermatitis，ACD）体外培养外周血淋巴细胞干扰素诱导蛋白10（IP－10）及其受体CXCR3表达的影响，进一步探讨雷公藤多苷治疗变应性接触性皮炎的机理。方法 用逆转录PCR（RT－PCR）及流式细胞术，检测不同浓度雷公藤多苷溶液体外培养48 h后的ACD患者外周血淋巴细胞中IP－10/CXCR3的表达。结果 雷公藤多苷高、中、低3个浓度组体外培养的ACD患者外周血淋巴细胞中IP－10 mRNA表达明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0．01）；3个浓度组间比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。雷公藤多苷3个浓度组体外培养的ACD患者外周血淋巴细胞表面CXCR3分子的表达低于对照组，只有高浓度组与之比较差异有统计学意义（P＜0．01）；高与低浓度组间比较差异有统计学意义（P＜0．05），其余组间比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 雷公藤多苷可以抑制体外培养ACD患者外周血淋巴细胞中IP－10 mRNA及其受体CXCR3的表达，从而抑制或减轻炎症的产生，或许是雷公藤治疗ACD机理之一。

雷公藤多苷；变应性接触性皮炎；干扰素诱导蛋白10；趋化因子受体CXCR3

变应性接触性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）是常见的变态反应性疾病，其发病机理复杂。近年来，趋化因子干扰素诱导蛋白10（Interferoninducible protein 10，IP－10）及其受体（Chemokinereceptor，CXCR3）在ACD发病中的作用受到重视[1]。雷公藤具有强大的抗炎、免疫抑制作用，临床使用其治疗ACD收到很好的效果，但其机制尚未完全明确。本研究通过观察雷公藤多苷对体外培养ACD患者外周血淋巴细胞趋化因子IP－10及其受体CXCR3表达的影响，试探讨雷公藤治疗ACD的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 40例ACD患者来自2015年6月—2016年1月济宁市第一人民医院皮肤科门诊，其中男22例，女18例，年龄21～70岁，平均（37．48± 12．41）岁，所有患者均符合《临床皮肤病学》[2]中有关ACD的有关诊断标准。选择从业查体的健康人员16例作为健康对照组，其中男10例，女6例，年龄19～35岁，平均（23．16±2．26）岁。

1.1.2 主要试剂及仪器 雷公藤多苷片（湖南协力）；PE标记抗人CXCR3荧光抗体（晶美）；超净工作台（苏净）；流式细胞仪（BD）；电泳仪（北京六一）；荧光定量PCR仪（ABI）；蛋白核酸定量测定仪（Eppendorf）；凝胶成像系统（伯乐）；RT－PCR试剂盒（大连宝生物）。

1.2 方法

1.2.1 雷公藤多苷溶液制备 称取10 mg雷公藤多苷溶于1 mL二甲基亚砜，加入9 mL的RPMI－1640培养液，然后取配好的上述液体0．5 mL，加入到9．5 mL的RPMI－1640培养液中，其浓度为50 μg/mL，滤菌分装。培养时雷公藤多苷的高、中、低浓度的终浓度分别为5．0、1．0、0．5 mg/L[3]。

1.2.2 外周血淋巴细胞的分离培养 ACD患者和健康者均空腹取外周静脉血5 mL，肝素抗凝，加入等量的Hanks液混匀，移液管吸取稀释血液加于淋巴细胞分离液上，保持淋巴细胞分层液与血样品之间的界限清晰，2 000 r/min离心20 min后，液体分为4层，吸取第二层白膜状的单个核细胞层液体，加入5倍量的Hanks液洗涤1次，1 000 r/min离心10 min，离心后将沉淀的细胞用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培养液配成单细胞悬液。取单细胞悬液加入24孔培养板，每孔0．5 mL，根据MTT试验结果，分别加入含有不同浓度雷公藤多苷的RPMI－1640培养液，以加有单细胞悬液而不含有雷公藤多苷的培养液孔为空白对照组，以健康人群作为健康对照组，混匀后放入含有5%CO2的CO2温箱内，37℃，培养48 h后进行实验检测。

1.2.3 RT－PCR法检测IP－10 mRNA 采用细胞总RNA Trizol试剂提取RNA，严格按照试剂说明书进行，取少量在紫外分光光度计260 nm和280 nm下确定浓度和纯度，并在1．2%的琼脂糖凝胶中电泳，然后进行凝胶成像分析。引物由宝生物工程（大连）有限公司设计合成，GAPDH为内参基因：IP－10：5’－GGCCATCAAGAATTTACTGAAAGCA －3’，5’ －TCTGTGGGTCCATCCTTGGAA－3’；GAPDH：5’－GC ACCGTCAAGGCTAGAAC－3’，5’－TGGTGAAGACG CCAGTGGA－3’。按照RT－PCR试剂盒方法对外周血淋巴细胞中IP－10 mRNA的相对表达量进行测定。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，再根据一定的阈值取其CT值，2－△△CT法测定IP－10 mRNA的相对表达量。

1.2.4 流式细胞术检测CXCR3 吸取培养孔内细胞，移入10 mL离心管中，1 500 r/min，离心5 min，吸弃上清；用1 mL PBS重悬细胞，分入2个流式试管中；分别离心，弃上清液，洗涤细胞1次，吸弃上清；每管分别加入10 μL PE CXCR3抗体；震荡，室温避光保存30 min；加入500 μL 4%多聚甲醛，流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法实验数据采用SPSS11．5统计软件处理，以均数±标准差（s）表示，计量资料比较采用方差分析进行统计，组间两两比较运用SNK检验。P＜0．05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IP－10 mRNA的表达 从IP－10的PCR产物的电泳图可看到，IP－10的产物大小为110 bP，GAPDH的产物大小为138 bP，IP－10和GAPDH的产物均符合设计的片段长度，见图1。雷公藤多苷高、中、低3个浓度组体外培养的ACD患者外周血淋巴细胞中IP－10mRNA表达均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0．01或P＜0．05）；雷公藤多苷3个浓度组间比较，差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

图1 IP-10及GAPDH的PCR产物的电泳图

2.2 CXCR3的表达 雷公藤多苷高、中、低3个浓度组体外培养的ACD患者外周血淋巴细胞表面CXCR3分子的表达均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0．01）；雷公藤多苷3个浓度组间比较，高浓度组与低浓度组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。

表1 雷公藤多苷对ACD患者外周血淋巴细胞IP-10 mRNA表达的影响(△CT)

表2 雷公藤多苷对ACD患者外周血淋巴细胞CXCR3表达的影响

3 讨论

干扰素诱导蛋白（IP－10）是由IFN－γ/或脂多糖诱导产生的一类属于CXC类亚家族的趋化因子，主要来源于单核巨噬细胞和T淋巴细胞，其可与表达在T细胞表面的受体趋化因子CXCR3结合促进其活化，招募T淋巴细胞、单核巨噬细胞等免疫细胞向病变部位聚集，促进炎症反应[4]。研究发现[5－6]，在毛细支气管炎患儿外周血淋巴细胞及结核性胸膜炎患者外周血血清中IP－10/CXCR3的表达均增加，提示IP－10/CXCR3参与了疾病的免疫应答过程和炎性反应。ACD是一种由CD4＋Th1细胞介导的Ⅳ型变态反应，IP－10在ACD中表达，其受体CXCR3在ACD中也呈优势表达[7]。有研究推测[8]，ACD中CXCR3与IP－10结合，诱导更多的Th1细胞聚集，介导免疫反应。

雷公藤多苷是雷公藤根的水－氯仿提取物，具有强大的抗炎和免疫抑制作用，单用或联合应用于多种免疫性及变应性皮肤病的治疗，取得了良好疗效[9]。徐晓光等[10]研究发现，经雷公藤多苷片治疗后的自身免疫性甲状腺炎大鼠，外周血细胞中的CXCR3 mRNA表达减少，推测可能是通过调整CXCR3的水平而抑制炎症的发生。雷公藤多甙治疗后的银屑病患者外周血CD4＋细胞降低至正常水平，推测雷公藤多苷可能通过抑制外周血中CD4＋细胞的活化，使进入皮损内的CD4＋细胞数减少，从而抑制CD4＋细胞释放细胞因子，表明雷公藤多甙可有效抑制银屑病患者外周血T淋巴细胞亚群活性[11]，而ACD正是一种由CD4＋Th1细胞介导的变态反应。罗育武等曾经使用雷公藤多苷片治疗ACD，疗效较好[12]。

本研究显示，雷公藤多苷可以明显抑制ACD患者外周血淋巴细胞中IP－10 mRNA表达，与邢艳玲等[13]的研究结果相似，但本研究所设雷公藤多苷浓度组间差异无统计学意义。雷公藤多苷也可以抑制体外培养的ACD患者外周血淋巴细胞表面CXCR3的表达，且高低浓度间抑制效果有差异。笔者推测，由于雷公藤多苷抑制了ACD患者淋巴细胞中趋化因子IP－10及其受体CXCR3的表达，诱导了T细胞的凋亡，减少了T细胞的数量，从而使炎细胞不能移行、募集到局部皮肤，从而抑制或减轻炎症的产生，或许是雷公藤治疗ACD机制之一。

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Effects of Glycosides on the Expression of Interferon Inducible Protein 10 and Its Receptor in Allergic Contact Dermatitis Patients

Li Yanhua1,Xu Jian2,Yu Teng3
1.Infectious Disease Hospital of Jining,Jining 272000,China;2.Jining Center for Disease Control and Prevention,Jining 272000,China;3.Jining NO.1 People's Hospital,Jining 272000,China.

ObjectiveIn order to observe the effect of Tripterygium Glycosides on interferon－inducible protein 10(IP－10) and its receptor(CXCR3)in allergic contact dermatitis(ACD)patients，thus further discusses the mechanism of this medicine in the treatment of contact dermatitis．MethodsThe expression of IP－10/CXCR3 in peripheral lymphocytes from ACD patients incubated in vitro with Tripterygium Glycosides was detected by reverse transcription PCR （RT－PCR）and flow cytometry．ResultsCompared with the control group，three different concentration groups of Tripterygium Glycosides remarkably suppressed the expression of IP－10 mRNA in vitro culture Splenic lymphocyte of ACD patients（P＜0．01）；while there was no significant difference among the three different concentration groups of Tripterygium Glycosides（P＞0．05）．Three different concentration groups of Tripterygium Glycosides all suppressed the expression of CXCR3 in vitro culture Splenic lymphocyte of ACD patients．There were significant differences between the high concentration group and the control group，the high concentration group and the low concentration group．ConclusionTripterygium Glycosides can obviously suppress the expression of IP－10/CXCR3 in vitro culture lymphocyte of ACD patients，which maybe one of the mechanisms of Tripterygium Glycosides'treatment on ACD．

Ripterygium glycosides;Allergic contact dermatitis；Interferon－inducible protein 10;Chemokine receptor CXCR3

R758.22

A

1672－0709（2016）05－0273－03

2016－02－01）

许建，E-mail:xujian20040703@126.com