转录因子在诱导多能干细胞神经分化中的作用研究

胡传钦 周丽萍 林德菊 余勤★

·综述·

转录因子在诱导多能干细胞神经分化中的作用研究

胡传钦 周丽萍 林德菊 余勤★

2006年，Takahashi等[1]通过逆转录病毒为载体，将四种转录因子（Oct3/4、Soχ2、Klf4和c-Myc）转染至小鼠成纤维细胞中，得到一种具有多能特性的细胞，被称为诱导多能干细胞（iPSCs）。iPSCs在许多方面与胚胎干细胞相似度较高，诸如DNA甲基化、基因表达谱、表面抗原、表观遗传状态及端粒酶活性等方面，并且具有向三胚层分化的特点[2]，因此，Yamanaka凭借iPSCs的成果获得了2012年诺贝尔医学或生理学奖。目前，科学家们已经利用iPSCs获得了胰岛细胞、干细胞、神经细胞等不同类型的细胞，而且成功利用iPSCs培养出了小鼠成熟个体，证明iPSCs具有与ESCs一样的全能性。同时，iPSCs又具有独特的优越性，其成功地规避了伦理道德问题，消除潜在的免疫排斥反应，给细胞移植技术提供了可靠的原材料。

近年来，以阿尔茨海默病、帕金森病为代表或以中枢神经系统功能障碍为主的神经系统疾病越来越引起人们的关注，干细胞通过自我增殖和分化成神经元细胞以替代已凋亡的神经细胞成为临床研究的热点。研究证明，iPSCs在特定的细胞因子作用下能分化成神经细胞[3]。苏肖英等[4]发现神经生长因子（NGFs）显著促使神经干细胞（NSCs）分化为神经元并促进相关信号因子磷酸化，从而促使NSCs向神经细胞分化。Atsukod等[5]发现一些生长因子在视神经退化过程中具有不同的表达变化。可见细胞因子在神经细胞的生长、增殖和凋亡过程中都扮演着不可或缺的角色。本文就iPSCs向神经细胞分化过程中发挥主要作用的细胞因子做一综述。

1 bHLH基因家族

碱性螺旋-环-螺旋基因家族（bHLH）能编码多种转录蛋白因子，通过这些蛋白，细胞能够向不同方向分化。bHLH家族基因上游富含碱性氨基酸可与相应的基因片段结合，在基因的转录方面具有调控作用。

1.1 Hes1因子 Hes因子是bHLH转录抑制因子的一种，其与动物神经系统发育有关。迄今为止，研究者共发现了七种Hes基因，其中Hes1在成神经分化过程中具有重要作用。Hes1基因编码的Hes1蛋白具有一个特殊的保守bHLH结构域，能与一些正调控的转录因子结合。例如与促进神经元分化的Ascl1结合，抑制Ascl1的表达而发挥负向调控作用，其在细胞内的高表达能使神经祖细胞保持未分化状态；而适当表达则可以控制神经干细胞进行不同功能的分化。Hes1蛋白在不同的部位具有差异性表达，例如成年小鼠海马中的齿状回和CA3区的表达不同。Akihiro等[6]在研究黄芩苷对人iPSCs向神经元方向分化的过程中发现，其能促进iPSCs向神经元分化和抑制向胶质细胞分化，减少细胞中Hes1蛋白的表达水平，当Hes1蛋白含量降低后，对iPSCs的抑制作用随之减弱，最后促进iPSCs向神经方向分化。

1.2 Neurogenin（Ngn）基因 Ngn同样是bHLH家族基因中的一员，主要在神经前体细胞中表达，控制着神经前体细胞的发育。Ngn基因家族主要包括Ngn1、Ngn2，具均能在神经系统中得到表达，而且人类和其他哺乳动物不完全相同。在哺乳动物大脑皮质发育过程中，Ngn1和Ngn2的表达具有差异性，表达部位和时期也不相同。Ngn与神经元的分化成熟密切相关，在神经发生的早期和晚期都需要Ngn1的表达，而Ngn2只在早期是必需的。Ngn1和Ngn2能与bHLH蛋白形成二聚体，通过碱性区域与带电的DNA序列结合，启动组织特异性表达。Ngn1基因编码的蛋白影响神经细胞的分化过程，而且在不同种类动物中具有不同的表达方式，其表达的特异性受到增殖的神经祖细胞的限制。同时，Ngn1的表达伴随着NSCs分化为神经元的增加而增加，而当细胞中β-catenin基因受到抑制时，Ngn1的表达会有所减少。同时研究发现，Ngn2基因在调控星形胶质细胞分化为神经元方面具有重要作用，主要通过促进神经蛋白的表达来实现，属于bHLH家族的激活型基因。

2 神经营养因子（NTF）

NTF作为一种多肽，能促进神经细胞存活、生长、分化，并且与受体结合。其家族成员包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3/4等。近年来，又发现了睫状神经营养因子家族（CNTF）、成纤维细胞生长因子（IGF）和表皮生长因子（EGF）等。神经营养因子是一种小分子碱性蛋白，在成熟神经系统中，在神经元的死亡、突触的可塑性、神经递质传递和神经再生等方面均有影响。

2.1 神经生长因子（NGF） NGF是发现于神经家族生长发育早期，对神经元的生长、发育、繁殖具有促进作用的。

NGF细胞内，与效应细胞的膜受体结合，沿轴逆向转运，经轴突至细胞核，引起生物学效应。在神经性疾病的研究中，NGF在疾病的发生、发展和预后中都有重要的作用。在神经干细胞的诱导分化上，NGF处理后的干细胞激活细胞内的PI3K/Akt信号通路，使PI3K激酶被激活，促使Akt转位于质膜上，转位于质膜上的Akt通过其308位苏氨酸和473位丝氨酸的磷酸化而被激活[7]，这些研究成果证明，NGF能调控细胞内神经分化和决定细胞的命运。

2.2 血管内皮生长因子（EGF） EGF作为一种同源二聚体糖蛋白，在结构上具有高度的保守性，在细胞分泌、血管内皮细胞增殖和增加血管通透性过程中具有重要作用。其作用于神经EGF受体，参与神经轴突的生长，影响神经细胞的分化，维持神经细胞的存活，并且保护神经元。在体外，EGF能够促进人胚胎干细胞神经分化，通过激活Notch信号通路而发挥促神经干细胞增殖作用。研究发现EGF对海马等脑组织内神经发生区的神经干细胞有促生长、提高存活率和趋化作用[8]。

3 其他家族影响因子

3.1 Nanog影响因子 Nanog基因是原始生殖细胞及胚胎干细胞表达的重要转录因子，维持干细胞全能型和增殖分化。研究发现胚胎发育的早期，Nanog不表达于早期卵裂阶段，而是在桑椹胚阶段先表达[9]。而且，Nanog基因在胚胎干细胞内高表达，诱导胚胎干细胞分化以后，Nanog的表达则会出现下调情况，表明维持胚胎干细胞的全能型与Nanog基因的表达有密切关系。自Takahashi等[1]通过病毒载体感染成纤维细胞而得到iPSCs后，发现其具有和胚胎干细胞类似的特性，比如增殖、多能性、表面标记和向三胚层分化等方面。有研究者将小鼠iPSCs移植至小鼠体内的囊胚腔，最后得到了具有繁殖能力的新成熟个体[10]。Liang等[11]发现在胚胎发育的早期，受到Nanog启动子转换信号Nodal/Smad2的调节，Nanog基因能够维持外胚层多能性的稳定。由于iPSCs与胚胎干细胞的相似性，诱导iPSCs的分化表达后，Nanog基因会随着分化成熟度而降低表达。

3.2 Sox2影响因子 20世纪90年代，科学家在研究决定性别的SRY基因是发现了一段保守的核苷酸序列，随后学术界将与其相关的一类相似基因命名为Sox基因。随着研究的深入，科学家发现Sox拥有多种亚族基因，这些基因在个体发育过程中发挥着重要作用，在性别决定和胚胎、神经系统、循环系统的发育均有影响。其编码的蛋白质具有结合DNA的能力，是一类重要的转录调控因子。Sox基因家族种类众多，例如Sox4基因是B淋巴细胞增殖的重要因素，Sox1在胚胎期能调控感觉神经元的发育。在神经系统中，和神经系统增殖分化有关的为Sox2。作为Sox转录因子家族成员之一，Sox2在细胞神经发育早期对维持自我更新及多向分化潜能具有关键性的调节作用，对其自身的分化命运具有重要的调控作用。Peretz等[12]发现小鼠后脑神经干细胞池中，Sox2具有重要的调控作用。在小鼠后脑发育初期，Sox2+细胞的表达具有统一性；但是随着发育过程的不断进行，部分细胞会呈现一种动态的Sox2高表达，并且这些细胞的表面抗体（HBs）会受到抑制。研究还发现后脑区域中，Sox2调控神经干细胞或神经祖细胞分化过程中，一些细胞因子（如Pax6、FGF3、PLZF1、Id1等）在不同细胞、组织中表达发育顺序相一致，而且在不同的实验动物中具有相同的趋势[13-14]。

3.3 Oct4影响因子 Oct4基因是POU转录因子家族中的一员，主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞中，其在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新方面发挥着关键作用。目前，Oct4基因发现较早，是一种高度保守的基因，在人和小鼠方面研究较多，有维持胚胎干细胞多能性和自我更新的作用。Zhou等[15]发现Oct4转录因子在诱导神经前体细胞重编程为iPSCs过程中，能提高重编程的有效率。同时在重编程过程中，稳定的β-catenin蛋白的表达，可以使Oct4与细胞凋亡因子Survivin结合，从而加强重编程后iPSCs的存活率。Han等[16]发现利用转录因子Oct4等诱导的iPSCs能够在体外成功分化为神经干细胞，并且移植诱导后的神经干细胞至PD大鼠的脑纹状体能是大鼠的体外回旋功能试验得到提高，并且在体内能够分化为神经元等细胞，说明Oct4转录因子参与诱导iPSCs向神经方向分化。

4 iPSCs成神经诱导分化的前景和展望

iPSCs在干细胞和生物学的研究领域具有里程碑式的意义，近年来取得一系列重大突破，使iPSCs临床应用又向前推进了一步。在iPSCs的神经分化方面，科学家们研究了不同细胞因子对iPSCs分化为神经细胞过程中的作用，为临床研究奠定了理论基础。目前已知的能对干细胞向神经分化的细胞因子种类仍然有限，相信随着研究的不断深入，iPSCs在神经系统疾病的临床治疗中将会展现不可估量的应用前景。

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国家自然科学基金（31570994），浙江省自然科学基金（LY15C100001）

310053 浙江中医药大学生命科学学院

*通信作者