感音神经性耳聋的基因治疗研究进展

吴皓 孙常领

耳聋是人类最常见的致残性疾病之一，据WHO 2013年的数据，全世界范围内约有3.6亿人遭受耳聋的困扰[1]。耳聋不但会造成严重的交流障碍，更为严重的是影响儿童的言语和认知功能发育[2]。耳聋可大致分为三种类型：传导性耳聋、感音神经性耳聋和混合性耳聋[3]。其中，感音神经性耳聋占耳聋的大部分。感音神经性耳聋是由于耳蜗毛细胞、听神经、听传导通路各级神经元受损害所导致的声音感受与神经冲动传递障碍，其常见的致聋因素有耳毒性药物使用、感染、噪声暴露、年龄及遗传因素等。部分感音神经性耳聋患者可以通过药物治疗，但绝大部分患者只能依靠配戴助听器和/或人工听觉植入提高听力[4]。然而，无论是助听器，还是人工听觉植入，都仅仅是一种替代治疗，其治疗效果仍不尽如人意，功能上无法与正常听力相比。

基因治疗是指通过操作遗传物质来干预疾病的发生、发展，通过替代和纠正异常的致病基因来达到治疗疾病的目的[5]。近年来，随着遗传基因与耳聋发病机制研究的不断深入，各种耳聋动物模型的建立，越来越多的学者试图通过基因治疗的方式来预防和治疗感音神经性耳聋。内耳膜迷路相对封闭、处于骨性迷路的包绕之中，与周围组织相对隔离；注入耳蜗内的载体可以通过流动的外淋巴液或内淋巴液在耳蜗内扩散[6]。由于这些特殊的解剖和生理特点，使耳蜗在基因治疗方面拥有其它器官无法比拟的优势，为内耳基因治疗提供了理想的环境。本文将结合最新的国内外研究进展，对感音神经性耳聋的基因治疗进展做一综述。

1 感音神经性耳聋基因治疗的主要策略

1.1 听神经的保护与再生

对于重度感音神经性耳聋患者，目前主要的治疗方法是人工耳蜗植入。然而人工耳蜗植入要求有一定数量的螺旋神经节细胞。术后效果取决于残存螺旋神经节细胞的数量。动物实验结果表明神经营养因子如脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）、神经营养因子-3（neurotrophin-3,NT-3）有助于耳聋后螺旋神经节细胞的存活[7～8]。有学者使用新霉素致豚鼠耳聋后1周，通过腺病毒和腺相关病毒向豚鼠耳蜗内导入BDNF，结果表明可有效保护螺旋神经节细胞并且能够促进其神经纤维向基底膜方向生长[9]。因此，基因治疗和人工耳蜗植入联合应用有望提高人工耳蜗植入的远期疗效。

1.2 毛细胞保护与再生

毛细胞是产生听觉冲动的感受器，人类的毛细胞一旦缺失，不可再生[10]。毛细胞的保护对于防止耳聋具有重要意义。现实生活中，大的环境噪声、耳毒性药物（如氨基糖苷类抗生素和顺铂）的使用均可导致毛细胞损伤。基因治疗可以通过表达某些具有保护作用的基因或沉默耳毒性发生过程中的某些关键基因起到保护毛细胞和听力的作用。Kawamoto以腺病毒为载体，通过在豚鼠耳蜗内过表达铜/锌超氧化物歧化酶（superoxide dismutase 1,SOD1），锰超氧化物歧化酶（SOD2），过氧化氢酶（catolase,CAT）成功地预防了卡那霉素导致的耳聋[11]。Cooper以腺相关病毒为载体通过表达X连锁凋亡抑制蛋白（x-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）来预防顺铂耳毒性[12]。Mukherjea通过鼓室内注射小干扰RNA来拮抗NADPH氧化酶3（NADPH oxidase 3,NOX3）来阻止注射顺铂后氧自由基的产生，从而预防毛细胞和螺旋神经节的损伤[13]。

一旦毛细胞发生死亡，治疗的重点就从毛细胞的保护转移到再生。随着毛细胞再生研究的深入，已发现了多个潜在的基因治疗靶点，其中最有代表性的是Atoh1基因[14]。Atoh1基因是毛细胞分化所必需的转录调节因子，已经有多项动物研究证明在内耳进行Atoh1基因的过表达，通过Corti器支持细胞的转分化实现了耳蜗和前庭毛细胞再生[15～17]。

1.3 遗传性耳聋的基因治疗

与其他致病因素导致的耳聋不同，遗传性耳聋的基因治疗不能通过毛细胞的再生来实现，而需要通过导入野生型的基因取代或补充致病基因的功能。近几年来遗传性耳聋的基因治疗研究取得了很大的突破，已经有多项研究通过基因治疗的方式逆转了遗传性耳聋小鼠动物模型的听力表型。包括GJB6、VGLUT3、TMC、KCNQ1在内的基因敲除小鼠，都通过向耳蜗内导入相应的野生型基因，成功地保留了部分听力[18～21]。这一系列研究成果预示基因治疗有望成为治疗遗传性耳聋的有效方法。

2 感音神经性耳聋基因治疗载体

基因治疗的开展首先需要有理想的基因治疗载体，目前常见的基因载体有病毒载体和非病毒载体两大类。由于转染效率较高，病毒载体是应用最为广泛的载体。用作耳聋基因治疗载体的病毒主要有腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒等。其中最为常用的是腺病毒和腺相关病毒。

2.1 腺病毒（adenovirus,AV）

腺病毒具备①感染非分裂和分裂细胞；②可高效、迅速地传递和表达基因；③易于制备；④基因组不整和进入宿主染色体而相对安全等优点。被广泛应用于内耳基因治疗的研究中[22]。Raphael通过圆窗膜注射的方法，将载有大肠杆菌β-半乳糖（LacZ）的腺病毒导入鼓阶内，结果显示耳蜗毛细胞、支持细胞、螺旋神经节细胞、血管纹、前庭膜、螺旋韧带均被转染，其中以螺旋神经节细胞转染效率最高[23]。其他研究也证实了腺病毒经鼓阶钻孔途径可以成功转染包括毛细胞、螺旋神经节细胞以及支持细胞在内的多种内耳细胞[24，25]。但是腺病毒有一定的毒性，免疫源性较强，并且只能实现目的基因的短暂表达（1个月），因此应用受到了很大限制[23，26]。

2.2 腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）

AAV无致病性和毒性，因被转染的基因整合入宿主的基因组内，所以能够长时间表达[27]。动物实验证明，AAV既能够感染毛细胞，又能够感染支持细胞[19～21]。不同血清型的AAV对耳蜗内细胞的转染效率也不相同，Askew通过小鼠耳蜗组织体外培养实验证明，在AAV1、2、6、8、9血清型中，AAV1/2对毛细胞的转染效率最高，体内实验也证实了这一点[20]。但是，腺相关病毒DNA装载量有限，制备比较困难，并且会引起宿主的免疫反应，限制了其应用[28]。

2.3 非病毒载体

与病毒载体相比较，非病毒载体具有诸多的优势，例如制备简单，毒性低，不会诱发宿主的免疫反应，对携带基因容量没有限制，可以通过生物学改造来获得多种生物学特性等。非病毒基因载体主要有阳离子脂质体、阳离子聚合物、纳米材料。近年来用于内耳基因治疗的非病毒载体主要有聚乙烯亚胺（polyethylene imine,PEI）[29]、聚酰胺-胺型树状物（PAMAM-D）[30]、羟基磷灰石纳米颗粒[31]、四氧化三铁纳米颗粒等[32]，但这些非病毒载体的转染效率相对较低。

理想的基因治疗载体应该具备以下条件：①在体内能够将DNA准确送入靶细胞和靶组织；②能够将DNA转运进入细胞核并高效表达；③转染效率较高，强度和时间可控；④安全性高；⑤易于大规模制备。现阶段，无论是病毒载体还是非病毒载体都还无法满足上述条件，感音神经耳聋基因治疗的开展，仍需要探索新型的基因载体。

3 感音神经性耳聋基因治疗载体导入途径

内耳血迷路屏障的存在、骨性结构包裹以及淋巴液流动的特点使得内耳适合于基因治疗。同时,也使得如何安全、高效地将目的基因转入至耳蜗内成为一个难题。因此，探索一条安全有效的内耳基因转移方法是开展内耳基因治疗的重要前提之一。目前在动物实验研究中常用的基因导入途径有以下几种：①经耳蜗开窗；②经半规管开窗；③经圆窗膜注射；④经完整圆窗膜渗透。

3.1 耳蜗开窗

经耳蜗开窗后，可以行鼓阶或中阶注射，相对于鼓阶注射，中阶注射能更加直接地将目的基因导入内淋巴，转染效率也更高，文献报道经中阶注射AAV后几乎可以转染耳蜗内所有类型的细胞。然而，无论是鼓阶注射，还是中阶注射均会造成一定程度的听力损失[33]。

3.2 半规管开窗

半规管开窗路径主要是在后半规管开窗，动物实验研究表明此种路径对听力的影响较小，但是，经此路径主要转染前庭细胞，较少转染耳蜗内毛细胞和支持细胞[24，34]。

3.3 经圆窗膜注射

将AAV经圆窗膜注射途径导入鼓阶后，目的基因可以表达于外淋巴间隙的间皮细胞，内、外毛细胞，支持细胞，螺旋神经节细胞[35]。但是经圆窗膜注射容易造成圆窗膜的破裂，形成外淋巴瘘，也会对听力造成轻微的影响[19]。

3.4 经圆窗膜渗透

经完整圆窗膜渗透可以通过鼓室内注射或者耳后切开途径来实现，操作简单，对听力影响小，是向内耳导入基因最为理想的一条途径。圆窗膜是位于中耳与内耳之间的唯一膜性结构，在正常情况下是一半透膜，通透性大小主要与渗透分子的大小、构型、浓度、脂溶性、所带电荷有关。许多种物质包括水、离子、大分子（如毒素）、抗生素、直径小于1μm的微球都能透过圆窗膜进入内耳[36]。然而，作为耳聋基因治疗常用载体，病毒却不易透过圆窗膜。因此，许多学者尝试采用易化剂（透明质酸、胶原酶等）来增加圆窗膜的通透性。Shibata等发现使用透明质酸预先处理圆窗膜可以明显增加圆窗膜对腺病毒的通透性，从而提高腺病毒在耳蜗内的转染效率[37]。国内王慧和夏力使用胶原酶处理圆窗膜后，通过圆窗膜渗透途径向豚鼠和小鼠耳蜗内导入AAV，取得了和经圆窗膜注射途径类似的转染效率[35，38]。

4 展望

感音神经性耳聋基因治疗的基础研究虽然已经取得了很大的进展，但是要实现临床转化还有很长的一段路要走。目前限制基因治疗向临床转化的主要障碍是缺乏理想的基因载体和基因导入途径。①基因治疗载体；鉴于非病毒载体的安全性较高，相对于病毒载体而言，非病毒载体更有希望成为耳聋基因治疗的理想载体。非病毒载体的主要缺点是转染效率较低和缺乏靶向性，如何提高非病毒载体的转染效率和靶向性是今后研究的热点。通过对纳米粒子表面进行多种修饰（如穿膜肽[39]和靶向配体[40]）的多功能复合基因载体也许是人类基因治疗载体发展的方向。②基因导入途径；目前最有希望进行临床转化的基因导入途径是经完整圆窗膜渗透。病毒载体通过新型易化剂对圆窗膜进行预处理；非病毒载体通过改变粒径，表面电荷，连接穿膜肽等方法有望进一步提高圆窗膜渗透途径的转染效率。如果上述问题能够得到解决，我们有理由相信在不远的将来基因治疗将成为治疗感音神经耳聋的有效方法。

[1]Richardson RT,Atkinson PJ.Atoh1 gene therapy in the cochlea for hair cell regeneration[J].Expert Opin Biol Ther,2015,15:417-430.

[2]Dawson PW,Blamey PJ,Rowland LC,et al.Cochlear implants in children,adolescents,and prelinguistically deafened adults:speech perception[J].J Speech Hear Res,1992,35:401-417.

[3]Petersen MB,Willems PJ.Non-syndromic,autosomal-recessive deafness[J].Clin Genet,2006,69:371-392.

[4]Wilson BS,Dorman MF.Cochlear implants:current designs and future possibilities[J].J Rehabil Res Dev,2008,45:695-730.

[5]Friedmann T.The evolving concept of gene therapy[J].Hum Gene Ther,1990,1:175-181.

[6]Agrup C,Gleeson M,Rudge P.The inner ear and the neurologist[J].Journal of neurology,neurosurgery,and psychiatry, 2007,78:114-122.

[7]Wise AK,Tu T,Atkinson PJ，et al.The effect of deafness duration on neurotrophin gene therapy for spiral ganglion neuron protection[J].Hearing research,2011,278:69-76.

[8]Bowers WJ,Chen X,Guo H，et al.Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea[J].Mol Ther,2002,6:12-18.

[9]Shibata SB,Cortez SR,Beyer LA，et al.Transgenic BDNF induces nerve fiber regrowth into the auditory epithelium in deaf cochleae[J].Exp Neurol, 2010, 223:464-472.

[10]Brignull HR,Raible DW,Stone JS.Feathers and fins: nonmammalian models for hair cell regeneration[J].Brain research,2009,1277:12-23.

[11]Kawamoto K,Sha SH,Minoda R,et al.Antioxidant gene therapy can protect hearing and hair cells from ototoxicity[J].Mol Ther,2004,9:173-181.

[12]Cooper LB,Chan DK,Roediger FC，et al.AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity[J].Otology &neurotology:official publication of the American Otological Society,American Neurotology Society[and] European Academy of Otology and Neurotology, 2006,27:484-490.

[13]Mukherjea D,Jajoo S,Kaur T，et al.Transtympanic administration of short interfering (si)RNA for the NOX3 isoform of NADPH oxidase protects against cisplatininduced hearing loss in the rat[J].Antioxid Redox Signal,2010,13:589-598.

[14]Bermingham NA,Hassan BA,Price SD，et al.Math1:an essential gene for the generation of inner ear hair cells[J].Science,1999, 284:1837-1841.

[15]Izumikawa M,Minoda R,Kawamoto K，et al.Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals[J].Nat Med, 2005,11:271-276.

[16]Schlecker C,Praetorius M,Brough DE，et al.Selective atonal gene delivery improves balance function in a mouse model of vestibular disease[J].Gene Ther,2011,18:884-890.

[17]Staecker H,Praetorius M,Brough DE.Development of gene therapy for inner ear disease:Using bilateral vestibular hypofunction as a vehicle for translational research[J].Hearing research,2011,276:44-51.

[18]Ahmad S,Tang W,Chang Q，et al.Restoration of connexin26 protein level in the cochlea completely rescues hearing in a mouse model of human connexin30-linked deafness[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104:1337-1341.

[19]Akil O,Seal RP,Burke K，et al.Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy[J]. Neuron,2012,75:283-293.

[20]Askew C,Rochat C,Pan B，et al.Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice[J].Sci Transl Med,2015,7:295ra108.

[21]Chang Q,Wang J,Li Q，et al.Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome[J]. EMBO Mol Med, 2015,7:1077-1086.

[22]Husseman J,Raphael Y.Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors[J].Adv Otorhinolaryngol,2009,66:37-51.

[23]Raphael Y,Frisancho JC,Roessler BJ.Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo[J].Neurosci Lett,1996, 207:137-141.

[24]Kawamoto K,Oh SH,Kanzaki S，et al.The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice[J].Mol Ther,2001,4:575-585.

[25]Luebke AE,Steiger JD,Hodges BL,et al.A modified adenovirus can transfect cochlear hair cells in vivo without compromising cochlear function[J].Gene Ther,2001,8:789-794.

[26]Thaci B,Ulasov IV,Wainwright DA,et al.The challenge for gene therapy:innate immune response to adenoviruses[J].Oncotarget,2011,2:113-121.

[27]Mingozzi F,High KA.Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV:progress and challenges[J].Nat Rev Genet, 2011,12:341-355.

[28]Jiang H,Couto LB,Patarroyo-White S，et al.Effects of transient immunosuppression on adenoassociated,virusmediated, liver-directed gene transfer in rhesus macaques and implications for human gene therapy[J].Blood,2006,108:3321-3328.

[29]Tan BT,Foong KH,Lee MM,Ruan R.Polyethyleniminemediated cochlear gene transfer in guinea pigs[J].Archives of otolaryngology--head &neck surgery,2008,134:884-891.

[30]Wu N,Li M,Chen ZT，et al.In vivo delivery of Atoh1 gene to rat cochlea using a dendrimer-based nanocarrier[J].J Biomed Nanotechnol,2013,9:1736-1745.

[31]Sun H,Jiang M,Zhu SH.In vitro and in vivo studies on hydroxyapatite nanoparticles as a novel vector for inner ear gene therapy[J].Chinese journal of otorhinolaryngology head and neck surgery, 2008,43:51-57.

[32]Kopke RD,Wassel RA,Mondalek F，et al.Magnetic nanoparticles:inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant[J].Audiology &neuro-otology,2006,11:123-133.

[33]Praetorius M,Baker K,Weich CM，et al.Hearing preservation after inner ear gene therapy:the effect of vector and surgical approach[J].journal for oto-rhino-laryngology and its related specialties,2003,65:211-214.

[34]Okada H,Iizuka T,Mochizuki H，et al.Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adenoassociated virus vectors[J].Otology &neurotology:official publication of the American Otological Society,American Neurotology Society[and] European Academy of Otology and Neurotology,2012,33:655-659.

[35]Xia L,Yin S,Wang J.Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector:a comparison of two approaches[J].PloS one,2012,7:e43218.

[36]Goycoolea MV.Clinical aspects of round window membrane permeability under normal and pathological conditions[J].Acta oto-laryngologica,2001,121:437-447.

[37]Shibata SB,Cortez SR,Wiler JA，et al.Hyaluronic acid enhances gene delivery into the cochlea[J].Hum Gene Ther,2012,23:302-310.

[38]Wang H,Murphy R,Taaffe D，et al.Efficient cochlear gene transfection in guinea-pigs with adeno-associated viral vectors by partial digestion of round window membrane[J].Gene Ther,2012,19: 255-263.

[39]Yoon JY,Yang KJ,Kim da E，et al.Intratympanic delivery of oligoarginine-conjugated nanoparticles as a gene (or drug)carrier to the inner ear[J].Biomaterials, 2015,73:243-253.

[40]Zhang Y,Zhang W,Johnston AH，et al.Targeted delivery of Tet1 peptide functionalized polymersomes to the rat cochlear nerve[J].International journal of nanomedicine,2012,7:1015-1022.