犊牛群发性肺炎鉴别诊断与药敏实验

吴丹丹，白云龙，李雪纯，周金玲，周玉龙

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

犊牛群发性肺炎鉴别诊断与药敏实验

吴丹丹，白云龙，李雪纯，周金玲，周玉龙

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

2015年3月，黑龙江省林甸花园乡某牛场，犊牛爆发咳嗽，死之前头往后仰抽搐，口腔里有唾液。通过对病死犊牛剖检结果可见，病灶主要集中在肺部，无菌采取病料进行细菌的分离鉴定，将所分离的细菌通过临床检查、生物学特性鉴定和PCR鉴定分析，确诊是由巴氏杆菌及化脓隐秘杆菌混合感染引起的肺炎从而导致死亡。动物实验也显示纯培养物对小鼠致死率较高，药敏试验表明这两种菌对链霉素、环丙沙星、氨苄西林、头孢呋肟等药物高度敏感。

巴氏杆菌；化脓隐秘杆菌；诊断

2015年3月黑龙江省林甸某牛场，3～4个月左右的牛犊开始出现异常，在早上突然出现抽搐，口腔里有唾液，之后死亡。从流行病学、临床症状、抹片染色镜检、实验室检察等多方面手段得出结论，及化脓隐秘杆菌和巴氏杆菌混合感染导致肺炎，最后致死。

化脓隐秘杆菌（Arcanobacterium pyogenes）是一种不运动，不形成芽孢的革兰氏阳性短杆菌。该菌是隐秘杆菌属中毒力最强的病原体，是经济型家畜（牛、羊和猪）的一种条件性致病菌，也是这些动物黏膜上的一种共生体，是引起牛发病和死亡的主要原因[1]。近年来化脓隐秘杆菌引起的犊牛肺炎发病率逐年升高，常出现爆发的情况[2]。目前已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子有4类，分别为化脓隐秘杆菌溶血素（Pyolysin，PLO）、胶原结合蛋白（CbpA）、神经氨酸酶（Nan）及菌毛合成蛋白（Fim）。PLO是A．pyogenes主要的毒力因子，属于胆固醇依赖性溶细胞素（CDC）家族，具有溶解各种动物血细胞的能力，包括多形核细胞和巨噬细胞[3-4]。化脓隐秘杆菌最早从牛的脓汁中分离到，主要寄生在动物的上呼吸道、消化道和泌尿生殖道等黏膜处，是一种条件性致病菌，可引起奶牛的乳腺炎、子宫内膜炎和子宫炎，引起肉牛和高产奶牛的肝脓肿、猪的肺炎等，给养殖业带来较大的经济损失[5]。

牛巴氏杆菌病又称牛出血性败血症，是由多杀性巴氏杆菌引起的一种急性热性传染病，是一种内源性致病菌，且对培养条件要求非常高。以高热、肺炎、急性肠炎以及内脏器官广泛性出血为主要特征。该菌抵抗力弱，在干燥空气中仅存活2～3 d，在血液、排泄物或分泌物中可生存6～10 d，但在腐败尸体中可存活1～6月；阳光直射下数分钟死亡，高温立即死亡。尤以带溶血的巴氏杆菌杀伤性最强，给养殖业带来巨大的危害。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与培养基Maker DL2000、premix Taq均购于TaKaRa公司，酒精、二甲苯、生理盐水、甘油、革兰氏染色液、营养琼脂培养基、营养肉汤、生化试验管（购于杭州滨和微生物试剂有限公司）、药敏片（购于上海伊华医学科技有限公司）。

1.1.2 病料无菌采取病死犊牛的各部分病变组织，取病变交叉部位。标记放在无菌培养皿中-20℃冰柜中冻存。

1.1.3 实验动物实验动物为昆明系小鼠，体重为18 g左右。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断对牛养殖的基本情况进行调查与分析，主要从牛舍的饲养管理情况（主要包括喂养的饲料、水、通风、光照、运动情况）、牛进行的保健工作（刚出生阶段、妊娠阶段使用的保健药品）、使用疫苗情况（疫苗厂家、使用疫苗的时间段）、养殖母牛规模，以及患病牛的大小，以及死亡率回复率的统计数字，再配合牛群是否有既往病史等方面着手。

观察病牛犊的临床症状，首先从外观，主要从肤色被毛、眼结膜、眼球颜色、鼻腔口腔、腹围宽度着手。再继续用手摸四肢的关节以及骨质的硬度着手。

对病死牛犊进行剖检，首先观察淋巴结和喉头是否肿胀、出血、充血。无菌打开腹腔，观察是否有积液，以及肠段、肠黏膜、大网膜等是否有寄生虫，观察肾脏、脾脏、胃、肝脏、胆囊表面是否出现肿大出血，有没有纤维素性渗出。开启胸腔观察是否有积液，以及肺脏、心脏、膈肌、胸膜是否出现粘连。将膀胱黏膜、胃黏膜等用水清洗后，观察是否有溃疡、出血等症状。将肾脏等出现病变的器官割开观察是否有结节、出血等状况。观察完之后，无菌采取病健结合部位于灭菌平皿中，准备下一步检测。

1.2.2 细菌分离取各个脏器病料涂片，利用革兰氏染色方法进行染色。根据显微镜观察结果，根据镜下细菌形态将细菌接种于不同的培养基，从而为鉴别细菌做铺垫。当接种在培养基上37℃培养24～48 h后，观察菌落的形态及生长状况，主要从湿润程度、大小、形态、硬度、突起程度、边缘、是否溶血方面进行观察用接种环挑取可疑菌落进行染色，观察其与预期菌株是否相似。如果相似用接种环挑取单菌落，置于新的血液琼脂培养基上进行纯化。

1.2.3 细菌鉴定

1.2.3.1 生化鉴定根据细菌分离的结果，用灭菌接种环勾取单菌落纯培养物分别接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、靛基质、硫化氢、卫矛醇等各种生化培养基中（与怀疑的菌落的生化反应相对应），37℃恒温培养24～36 h后观察并记录结果[2]（培养时主要根据该菌对氧的需求进行培养）。

1.2.3.2 PCR鉴定根据GenBank中登录的猪源A．pyogenes PLO序列（AB027461），应用Oligo 6.0软件设计引物，扩增牛源PLO基因。上游引物P1 5'-GGTTGAGTTAAGGAAGGCGGAAG 298-320bp；下游引物P2 5'-TCGTTGCGGTAACTCACTAGGA-3’1924～1945bp引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。同时引入巴氏杆菌的特异性kmt基因的引物。

细菌基因组提取DNA及PCR扩增，参照文献[6]进行细菌基因组DNA制备，-20℃保存备用，即可作为PCR反应的模板，设计一个25 μL的反应体系，P1和P2各1 μL，Mix（Taq酶、dNTP、buffer、去离子水）12.5 μL，去离子水8.5 μL，DNA模板2 μL；PCR扩增条件为：95℃2 min，94℃90 s，53.5℃1 min，72℃2 min扩增30个循环，最后72℃延伸10 min。取PCR产物加于1.0%琼脂糖凝胶中，用凝胶成像系统中观察结果，根据电泳图片分析片段大小（以Maker DL2000 bp为标准参照），观察结果是否在标准区间内。

1.2.4 动物实验将菌种放入液体培养基中根据所需时间、温度、氧分培养，各取1 mL菌液，离心之后选取上层清液，抽取0.2 mL上清液、0.2 mL菌液十倍稀释液、0.2 mL注入纯菌液给编号为1、2、3的小鼠进行尾静脉，对每只做好标记，同时设立一只对照（注入生理盐水即可）。记录注射后小鼠的精神状态、毛色、死亡数量及死亡时间。

1.2.5 药敏试验用灭菌生理盐水100 μL将纯化好的病原微生物在原培养基上刮下混匀，用移液枪吸取50～100 μL至待做药敏试验的新血平板上，用灭菌L棒蘸取菌液均匀涂抹到整个血液琼脂培养基上，均匀分配贴上各种药敏片，每个培养基上平均贴7片，37℃倒置培养24～48 h（根据菌种所需的培养条件差异可做更改）后判定结果。判定参照美国实验室标准委员会（NCCLS）药敏纸片扩散法法规。

2 结果

2.1 临床诊断结果

黑龙江省林甸乡某牛场饲养的200多头牛，饲养管理及保健都做得很好，于3月牛犊出现抽搐，口腔唾液增多后死亡，牛犊曾患过群发性咳嗽，治愈率可达90%～95%。最初没有有特征性的临床症状（在死前一天也没有什么症状），在死亡之前会有头颈后仰，四肢抽搐，嘴里唾液增多的现象。

对该牛进行剖检打开腹腔即发现腹腔积液淋巴结肿大。肺部有淤血心叶尖叶膈叶有小叶性肺炎（支气管肺炎），表面水肿、肝样变末端发展成大叶性肺炎，肺表面有疑似脓包。肝肿大，胆囊肿大。肾脏出血严重，肠系膜充血、出血、溃疡。心肌有出血。肺部有脓包怀疑为结核结节，抹片镜检。根据剖检结果，肠系膜充血、出血、溃疡怀疑为黏膜病。全身主要脏器出血严重疑为败血症，进行细菌分离怀疑为巴氏杆菌。

图1 肺水肿肝样变Fig.1 Pulmonary edema liver sample

图2 肺部表面疑似脓包Fig.2 Suspected pustules on the surface area of the lungs

图3 肠系膜出血充血溃疡Fig.3 Mesenteric congestion bleeding ulcer

图4 肾表面出血Fig.4 Surface of renal hemorrhage

2.2 细菌分离结果

肺部脓包进行抗酸染色，镜检没有保持红色的抗酸性细菌，没有结核杆菌、副结核杆菌。胃黏膜大量出血进行抹片检查，并未分离出牛病毒性腹泻病毒，即排除黏膜病的可能。

将内脏病料接种于血液琼脂培养基上，在37℃下24 h以内长出一种菌，菌落表面光滑，边缘整齐，湿润，呈灰白色、不溶血、很软的大菌落。而在37℃下36 h长出另一种菌在血液平板上形成光滑、致密、湿润、灰白色的针尖状小菌落，菌落周围呈现明显的β溶血环[7]。采取病死牛肺病料，分别制成涂片与血液平板，用革兰氏染色镜检，可在各病料涂片中均可见两极浓染的革兰氏阴性球状杆菌。而另一个呈现革兰氏阴性的小杆菌，菌体呈明显的两极浓染。基本符合巴氏杆菌与化脓隐秘杆菌的形态[8]。分别挑取单菌落，涂在新的血液平板上，将两种菌纯化出来之后分别进行涂片染色镜检，其中一个可见革兰氏阳性棒状杆菌，单在或成丛，无明显链状存在。进行细菌纯化。

2.3 细菌鉴定结果

2.3.1 生化鉴定结果生化试验结果（见表1、表2）。从表中可见，所分离的菌株其生化反应结果符合巴氏杆菌与化脓隐秘杆菌所具备的生化特性。

表1 巴氏杆菌生化试验结果Table 1 Pasteurella biochemical test results

表2 化脓隐秘杆菌生化试验结果Table 2 Arcanobacterium pyogenes biochemical test results

2.3.2 PCR鉴定结果以提取化脓隐秘杆菌总DNA为模板，应用P1和P2引物进行PCR扩增得到目的片段约为1 600 bp，巴氏杆菌kmt基因约为580 bp，其结果与预期结果相似[9]，如下图：

图5 牛化脓隐秘杆菌plo基因扩增结果Fig.5 Claves Arcanobacterium pyogenes plo gene amplification result

2.4 动物实验结果

接种上清液的1号小白鼠，在接种后第四天死亡，3号小鼠于隔一天之后死亡，剖检死亡小白鼠，采取小白鼠肺部触片染色镜检看见两极着色的单个或成双存在的杆菌，死亡小白鼠肺脏接种与血液平板分离到灰白色、湿润、光滑、隆起、边缘整齐的菌落，革兰氏染色细菌呈红色小杆菌，单个或成双存在，两极着色。在这其中混杂几个革兰氏阳性的呈紫色的短杆菌，与之前分离出来的菌颜色形状极其相似。

2.5 药敏试验结果

结果表明，经过细菌分离实验分离出的巴氏杆菌，根据其抑菌环大小，可以判断出，它对链霉素极度敏感、对四环素、环丙沙星高度敏感，对阿奇霉素、阿莫西林、头孢唑林中度敏感，而对丁胺卡那和新霉素不敏感。而由细菌分离实验分离出的化脓隐秘杆菌，对头孢呋肟、氨苄西林极度敏感，对四环素、氟苯尼考高度敏感，对丁胺卡那、多粘菌素中度敏感。

3 结论

根据临床诊断包括流行病学检查、临床症状和剖检变化；细菌的分离培养鉴定，生化试验及动物试验、PCR检测为阳性。综上所述可诊断出此病为化脓隐秘杆菌与巴氏杆菌混合感染，导致肺炎及败血症致死。

4 讨论

化脓性隐秘杆菌为条件性病原菌，可引起化脓性肺炎[10]。巴氏杆菌虽不是条件性致病菌，但多杀性巴氏杆菌可存在于健康牛的上呼吸道，病是一种急性、热性、出血性、败血性传染病，可引起纤维素性胸膜肺炎，病程短促[11]。这两种疾病在临床表现、病理变化等方面有着较为明显的区别。研究中的发病犊牛的病程较长，病例零散发生，同一牛场的青年牛未发生此类疾病。患病犊牛在临床症状、病理变化等方面所呈现的巴氏杆菌症状也不甚典型，而隐秘杆菌病临床特征明显，因此，确诊此次犊牛发生的疾病为犊牛化脓性隐秘杆菌病，巴氏杆菌诱发继发感染。

犊牛所带的隐秘杆菌为出生后感染，其主要感染阶段为生后1周，不及时预防会诱发巴氏杆菌继发感染。因此，加强新生犊牛的饲养管理和疫病预防工作是防控本病的重点。建议从下几个方面着手：第一，认真做好断脐工作，切实做好脐带断端的消毒工作，因为脐带感染可能是初生犊牛感染本病的一个途径。第二，喂好初乳。第三，在发生该病的牛场，犊牛在出生后应连续3～4 d注射对本菌敏感的抗生素，对预防本病发生有显著效果。由于各奶牛场在治疗牛病时习惯用的抗生素种类不尽相同，化脓性隐秘杆菌会形成不同的耐药性，各牛场在针对本病进行预防时应选用不同的抗生素，不可生搬硬套。

［1］Confe A W.Update on bacterial pathogenesis in BRD［J］. Anim Health Res Rev，2009，10（2）：145-148.

［2］Erta H B，Kilic A，Ozbey G，et al.Isolation of Arcanobacterium pyogenes from abscessed cattle kidney and identification by PCR［J］.Turk J Vet Anim Sci，2005（29）：455-459.

［3］Ding H，Lämmler C.Purification and further characterization of a haemolysin of Actinomyces pyogenes［J］.Zentralbl Veterinarmed B，1996，43（3）：179-188.

［4］贺冬梅，陈朝喜，尹逊慧.水貂源大肠杆菌对9种抗菌药物敏感性试验［J］.西南民族大学学报：自然科学版，2015，41（5）：544-547.

［5］Machado V S，Bicalho R C.Complete genome sequence of Arcanobacteriumpyogenes，animportantopportunistic pathogen of livestock［J］.Genome Announcements，2014，2（2）：e00400-e00414.

［6］王密，周玉龙，朴范泽.牛化脓性隐秘杆菌病PCR诊断方法的建立［J］.微生物学报，2010，37（9）：1320-1324.

［7］沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［M］.北京.高等教育出版社，1996.

［8］刘明春，刘耀川，赵敏翠，等.奶牛子宫内膜炎化脓隐秘杆菌16s rRNA基因的鉴定与分析［J］.中国兽医学报，2009，29（3）：343-345.

［9］肖淦文，陈颖钰，彭清洁，等.支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌多重PCR快速检测方法的建立［J］.中国奶牛，2012（21）：4-7.

［10］侯引绪.新编奶牛疾病诊断与防治［M］.赤峰：内蒙古科学技术出版社，2004.

［11］肖定汉.奶牛病学［M］.北京：中国农业大学出版社，2012.

［12］胡丹，崔超伟，燕传利，等.伴有对侧乳房严重骨化的犬乳腺癌的病理学观察［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，26（3）：47-51.

［13］赵敬翠，李杰，刘耀川，等.化脓隐秘杆菌的特性及化脓隐秘杆菌病的防治［J］.兽医科技，2009（6）：92-93.

Differential Diagnosis and Drug Sensitive Test for Pneumonia Outbreaks in Calves Group

Wu Dandan，Bai Yunlong，Li Xuechun，Zhou Jinling，Zhou Yulong
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In March 2015，a crop of calves broke out cough，and their head backed，jerked and dribbled at the mouth before they died in the Lindian county of Heilongjiang province.The results of necropsy of the dead calves showed that lesions mainly occurred in the lungs.Then pathologic materials were asepticlly collected to isolate and identify bacteria.The findings of the clinical examination，the biological characteristics and PCR assay of the obtained bacteria indicated that pneumonia of calves group was caused by mixed infection of pasteurella and arcanobacterium pyogenes，which resulted in the death of calves group.Animal experiments also showed that the pure cultures had high fatality rate in mice.Drug sensitive test suggested that these two kinds of bacteria were highly sensitive to streptomycin，ciprofloxacin，ampicillin and cephalosporins cefuroxime oxime，which provided reference to use drug in the clinic.

arcanobacterium pyogenes；pasteurell；diagnosis

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0092-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.019

2015-12-10

黑龙江省自然基金（QC2013C029）。

吴丹丹（1989-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2014级硕士研究生。

周玉龙，男，副教授，E-mail：zhouyulong1980@163.com。