牛产气荚膜梭菌黑龙江分离株的分型鉴定

王华欣，刘宇，赵静虎，刘通，周金玲，岳山，何泊宁，刘珊珊，张世勋，王天，刘增禄，朱战波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

牛产气荚膜梭菌黑龙江分离株的分型鉴定

王华欣，刘宇，赵静虎，刘通，周金玲，岳山，何泊宁，刘珊珊，张世勋，王天，刘增禄，朱战波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

为了对三株未知型牛源产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens，Cl.perfringens）进行基因分型鉴定，将三株未知型菌株进行厌氧培养、纯化，观察培养特性，进行革兰氏染色镜检以及生化管鉴定，根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因以及产气荚膜梭菌16S rRNA保守基因分别合成5对引物，建立PCR方法。经培养特性、革兰氏染色镜检、生化特性以及16S rRNA保守基因细菌PCR鉴定均符合产气荚膜梭菌，PCR结果表明，三株产气荚膜梭菌均为A型。

产气荚膜梭菌；16S rRNA；PCR；基因分型

产气荚膜梭菌是人和动物胃肠道中的常在菌，也普遍存在于土壤和污水中[1-3]。该菌可引起各种家畜以及人类多种疾病的发生，主要有创伤性感染、恶性水肿，还会引起猪、马还有反刍动物等的肠毒血症，羔羊痢疾，绵羊猝狙；反刍动物感染还有可能引发猝死症，尤其是牛猝死症比较常见；对于犬、猫和人还会引起腹泻等症状[4]。产气荚膜梭菌所产生的毒素种类较多，有研究报道仅外毒素就多达18种[5-6]。产气荚膜梭菌根据其产生四种主要致死性毒素（α、β、ε和ι）的能力不同而被分为A、B、C、D、E五种类型[7]，各型的产气荚膜梭菌均能引起牛发病，其中尤以A、C、D型菌感染居多。其中，A型菌是人食物中毒和人畜气性坏疽的最常见病原。

国外报道的由产气荚膜梭菌引起的牛病主要以C、D型菌导致的牛坏死性肠炎或肠原性毒血症较多；国内由A型产气荚膜梭菌引起的成年牛“猝死症”为主[8]，也有C、D型菌致病，B型菌主要引起犊牛肠毒血症或坏死性肠炎，E型菌也可致犊牛肠毒血症，但很少发生。20世纪90年代以来，规模化养殖得到普及，该菌引起的疾病传播也日趋严重，牛的发病数量急剧增多，发病地区也不断扩大[9]。目前，由该菌引起的疾病已广泛分布于全国各地，对我国畜牧行业的发展形成了很大的困扰和严重的阻碍[10]。

1 材料

1.1 菌株

菌种为实验从猝死牛肠道分离鉴定获得的致病菌株。

1.2 主要试剂

厌氧肉肝汤（FT）培养基（购自青岛高科园海博生物技术有限公司），Taq DNA聚合酶、DNA Maker购自TaKaRa公司，质粒DNA提取试剂盒购自axygen科技有限公司。

2 方法

2.1 引物设计

根据产气荚膜梭菌的四种主要毒素（αβει）基因的序列，参照Yoo（1997），Marchesi（1998）等[11-12]文献合成PCR引物。基因长度分别为402、236、541、317和1 387 bp。引物序列分如下：

cpa-F cpa-R cpb-F cpb-R etx-F etx-R itx-F itx-R 63f 1 387r 5′-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG-3′5′-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC-3′5′-ACTATACAGACAGATCATTCAACC-3′5′-TTAGGAGCAGTTAGAACTACAGAC-3′5′-ACTGCAACTACTACTCATACTGTG-3′5′-CTGGTGCCTTAATAGAAAGACTCC-3′5′-GCGATGAAAAGCCTACACCACTAC-3′5′-GGTATATCCTCCACGCATATAGTC-3′5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′

2.2 产气荚膜梭菌的培养

取超低温冰箱保存的S-1401、HXL-1501、BQL-1303三种牛源性产气荚模梭菌冻干保存的菌种，接种于液体FT培养基中，上部加入1 mL液体石蜡以隔绝氧气，放置于37℃恒温培养箱中，培养12 h后，观察细菌的生长情况。

2.3 产气荚膜梭菌的纯化与镜检

将培养好的菌液进行血琼脂板纯化，于显微镜下观察其运动性，并进行革兰氏染色。

2.4 产气荚膜梭菌的生化特性鉴定

生化鉴定主要包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、靛基质、甘露醇、水杨苷、硝酸盐、水解明胶、硫化氢生化管11项生化指标鉴定试验。将鉴定管置37℃恒温箱中培养，培养24 h观察结果。

2.5 质粒DNA的提取

细菌培养液体培养物经离心后取其沉淀，后续按质粒DNA提取试剂盒进行。

2.6 四种主要毒素（αβει）基因的扩增

扩增体系：DNA聚合酶12.5 μL，灭菌水，10.5 μL，质粒DNA1 μL，上下游引物各0.5 μL。扩增条件：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min（30个循环）；72℃延伸5 min。

3 结果

3.1 产气荚膜梭菌的复苏培养

三株产气荚膜梭菌在FT培养基中培养12 h后即变浑浊，同时可见有大量的气泡产生。

3.2 产气荚膜梭菌的纯化

产气荚膜梭菌在牛血琼脂平板上厌氧培养12 h后，均形成边缘光滑整齐、灰黄色的圆形菌落，且在菌落周围可见明显双环溶血现象，内环为完全溶血，外围为不完全溶血环。

3.3 产气荚膜梭菌的生理生化鉴定结果

显微镜下官产产气荚膜梭菌无鞭毛、没有运动性。革兰氏染色为阳性菌，菌体呈直杆状，两端钝圆，单独或成对存在。生化鉴定除靛基、甘露醇、水解明胶外均为阳性结果，符合产气荚膜梭菌生化特性。

3.4 PCR鉴定结果

三株产气荚膜梭菌分离株经16S rRNA病原菌PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明在1 387 bp的16S rRNA被有效扩增（图1），大小正确。血清型PCR和测序结果结果均表明三株产气荚膜梭菌分离株均为A型，对应条带大小为别为402 bp。

图1 牛产气荚膜梭菌分离株16S rRNA病原菌检测Fig.1 Cattle clostridium perfringens 16S rRNA pathogen detection

图2 牛产气荚膜梭菌分离株α毒素基因检测结果Fig.2 Identification of serotype of clostridium perfringens isolates

4 讨论

近年来有很多关于A型产气荚膜梭菌引起畜禽感染的报道，通常认为一些动物的坏死性肠炎、下痢与A型菌株的感染有关，“牛猝死症”的研究发现A型产气荚膜梭菌是其中的主要病原之一。有研究人员曾用ELISA分型以及多重PCR分型方法对牛舍空气中分离出的产气荚膜梭菌进行研究，研究表明，A型菌的比例高达88%[13]。本病在黑龙江省内牛感染A型B型D型产气荚膜梭菌均有报道[14-15]。另外，黑龙江省内仔猪感染C型产气荚膜梭菌引起梭菌性肠炎，致死率较高。绵羊感染C型产气荚膜梭菌猝击也有报道。

实验所用三株毒株来自于黑龙江省不同地区猝死的肉牛，对其进行培养特性观察，革兰氏染色镜检、生化管鉴定以及16S rRNA病原菌检测，各项检测结果均与产气荚膜梭菌的特性相符。在产气荚膜梭菌基因组中，α、β、ε和ι四种毒素基因比较保守，且在产气荚膜梭菌不同血清型菌株中存在差异。研究根据genbank中登载的产气荚膜梭菌毒素基因序列，并参考有关文献设计合成特异性引物，PCR鉴定结果未发现B、C、D、E型的目的条带，16S rRNA测序结果显示与A型产气荚膜梭菌具有很高的同源性。三株牛源产气荚膜梭菌分离株均为A型，与国内的一些牛产气荚膜梭菌流行病学调查结果相符，国内由产气荚膜梭菌引起的牛病以A型为主[10-15]。

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Typing Identification of Cattle Clostridium Perfringens Isolate in Heilongjiang Province

Wang Huaxin，Liu Yu，Zhao Jinghu，Liu Tong，Zhou Jinling，Yue Shan，He Boning，Liu Shanshan，Zhang Shixun，Wang Tian，Liu Zenglu，Zhu Zhanbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Three cattle clostridium perfringens strains which types were unknown were anaerobic cultured，purified and observed culture characteristics，gram stain microscopy and biochemical tube identification were usedto identify their genotypings.PCR method was established based on the clostridium perfringens α，β，ε and ι toxin gene and clostridium perfringens 16SrRNA conserved genes，compounded five pairs primer.Results showed that culture characteristics，gram stain microscopy，biochemical properties，16S rRNA conservative germs PCR identification accorded with clostridium perfringens.The result of PCR indicated that all three clostridium perfringens strains were type A.

clostridium perfringens;16S rRNA;PCR;genotyping

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0089-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.018

2016-08-10

科技部科技支撑计划课题（2014BAD13B03-1）；省农垦总局课题（HNK135-04-03）。

王华欣（1991-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2014级硕士研究生。

朱战波，教授，博士研究生导师，E-mail：zhanbozhu@163.com。