BVDV P7蛋白的原核表达及其生物信息学分析

李田田，翟军军，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

BVDV P7蛋白的原核表达及其生物信息学分析

李田田，翟军军，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

为了对BVDV-1 P7蛋白进行原核表达及生物信息学分析，采用RT-PCR的方法扩增BVDV NADL株BVDV-1 P7的ORF，扩增产物经BamH I、Sal I双酶切后插入原核表达载体pEGX4T-1（+），构建P7基因原核表达载体并将其转化至工程菌E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达，并对其进行生物信息学预测。结果表明，成功扩增并构建了BVDV NADL株的BVDV-1 P7原核表达载体，命名pEGX4T-1-P7。SDS-PAGE和Western blot表明，在分子质量34 kDa的位置出现与预期大小一致的蛋白条带；生物信息学结果表明在P7蛋白有信号肽，存在疏水区。该研究成功的表达了P7蛋白，该蛋白是一个疏水性蛋白，为其进一步的功能研究奠定了坚实的基础。

BVDV；P7基因；原核表达；生物信息学

牛病毒性腹泻粘膜病病毒（Bovine Viral Diarrhea-mucosal Disease Virus，BVDV）是引起牛病毒性腹泻粘膜病的病原。欧美牛体中普遍存在轻性或隐性感染，与猪瘟病毒（HCV）、羊边界病病毒（BDV）具有同一种抗原有交叉反应，牛体中的抗体检出率高[1]。BVDV可以感染绵羊、猪、骆驼、山羊和其他野生动物，宿主广泛，其中牛的感染最多。是一种人畜共患病，近年来已经有报道。其临床表现为发热、母畜流产、胎儿畸形、咳嗽、腹泻等症状，给养殖业带来很大的损失[2]。

BVDV根据能否引起细胞病变分为两种生物型：非致细胞病变型（NCP型）和致细胞病变型（CP型），虽然有明显的抗原异质性和显著的种间遗传，但BVDV仅有一种血清型。BVDV为单股正链RNA病毒，有囊膜，基因组全长约12.3～12.5 kb，5’端无“帽子”结构。编码一个高分子质量的多聚蛋白，该蛋白被加工成11种蛋白质。其中有4种是结构蛋白，剩余7种为非结构蛋白。BVDV基因组中编码这11种蛋白质的基因相对位置为Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2/3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B[3]。P7这个小的多肽将E2和NS2/3隔离开，相对分子质量为6～7 kDa，主要由疏水性氨基酸组成。不同的瘟病毒属的P7蛋白的疏水区和预测结构是保守的。P7蛋白是一种病毒孔蛋白，病毒孔蛋白是一种参与病毒复制周期的包含膜通透性修饰和促进病毒释放的病毒蛋白，是最小的内膜蛋白，在病毒的装配和促进透化作用上起作用。

实验对BVDV-1 P7基因进行了克隆，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹分析重组P7蛋白表达后的反应原性，并对P7基因的生物信息学进行分析，为更好的研究BVDV病毒孔蛋白的机制提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

BVDV-1 NADL株病毒购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 质粒与菌种

pEGX4T-1质粒、大肠杆菌E.coli BL21由本实验室保存。

1.1.3 主要试剂

限制性内切酶BamHI、SalI，反转录试剂盒，Taq DNA聚合酶，DNA Marker DL2000，蛋白Marker，T4 DNA连接酶等均购自大连宝生物工程公司。小量质粒提取试剂盒、微量胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BVDV P7的基因扩增

根据GenBank公布的BVDV-1 NADL分离株P7基因序列（登录号：AJ133738）和原核表达空载体pEGX4T-1（＋）序列，设计合成一对寡聚核苷酸引物F1/F2（forward primer：CG GGATCC ATG ATT CAG TAT GGA TCA GGG GAA GTG G；reverse primer：GC GTCGAC TTA GGC CTT TAC CAC ATC CCC AAT C），引入BamHⅠ、SalⅠ酶切位点。设计引物送北京华大生物工程公司合成。

将淋巴组织总RNA（Trizol法提取）逆转录为cDNA后作为模板扩增BVDV-1 P7基因片段，采用50 μL反应体系：其中包括5 μL模版，5 μL 10× Buffer，5 μL dNTPmix，0.5 μL Taq酶，上下游引物各1 μL，加水50 μL。以上样品混均后并瞬离。PCR反应条件：96℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35个循环，72℃5 min。吸取2 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（浓度为1%）检测并用胶回收试剂盒回收剩余产物。

1.2.2 pEGX4T-1-P7原核表达载体的构建

将回收后的上述扩增产物和pEGX4T-1质粒分别用BamHI和SalI双酶切。分别回收目的片段和载体片段，16℃过夜连接，转化E.coli DH5α感受态细胞。进行重组质粒PCR和酶切鉴定，取酶切鉴定正确的送华大基因测序。

1.2.3 重组质粒pEGX4T-1-P7转化E.coli BL21

取上述测序结果鉴定正确的pEGX4T-1-P7质粒转化制备好的E.coli BL21感受态细胞进行诱导表达。

1.2.4 SDS-PAGE鉴定

表达菌E.coli BL21在42℃诱导10 h后，从试管中吸取5 mL菌液，室温12 000 rpm离心1 min后弃上清液，用PBS振荡重悬沉淀，5 000 r·min-137℃离心45 min；再次弃去上清液；反复3次。反复冻融3次，离心将上清液和沉淀分开，用裂解液把沉淀重悬。将上清和沉淀加入Buffer混匀，煮沸10 min后放入-20℃冰箱，以备后续使用。将空载体转化后相同条件诱导菌作为实验的阴性对照。

制备SDS-PAGE凝胶，上样，考马斯亮蓝染色后终止。

1.2.5 重组蛋白Western blot分析

取15 μL融合蛋白按照上述步骤进行SDSPAGE电泳，凝胶半干转PVDF膜后，一抗为小鼠抗BVDV-1阳性血清，37℃孵育45 min，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体，孵育1 h后，DAB显色，EDTA（pH8.0）终止，观察目的条带。

1.2.6 BVDV P7蛋白的生物信息学分析

氨基酸序列理化性质预测：ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）；

二级结构预测：SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）；

信号肽结构在线预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/；

疏水性分析由ProtScale（http://web.expasy.org/ protscale/软件完成。

2 结果

2.1 BVDV P7基因的扩增

P7基因用F1/F2引物扩增，经琼脂糖凝胶电泳后的PCR扩增产物大小为200 bp，与预期结果相符（图1）。

图1 P7基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of P7gene

2.2 重组表达载体pEGX4T-1-P7的鉴定

用BamHI/SalI双酶切重组质粒pEGX4T-1-P7，经琼脂糖凝胶电泳检测到200 bp附近有条带，与理论片段216 bp大小相符（图2）。P7基因片段成功插入pEGX4T-1载体。

图2 pEGX4T-1-P7的双酶切鉴定Fig.2 Double enzyme identification of pEGX4T-1-P7

2.3 重组蛋白pEGX4T-1-P7的诱导表达及鉴定

通过对重组菌SDS-PAGE结果的分析能观察到34 kDa处有明显的的条带，为重组蛋白pEGX4T-1-P7的表达带（图3）与预期结果相符合。

图3 重组蛋白pEGX4T-1-P7的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein pEGX4T-1-P7

2.4 表达产物Western blot鉴定

通过对重组菌的Western blot进行分析能观察到在34 kDa处有明显的条带，与理论值一致（图4）；表达的重组蛋白通过Western blot分析表明能够与抗BVDV-1抗体发生特异性的免疫学反应，该结果证实了表达后的重组P7蛋白具有良好反应原性。

图4 重组蛋白pEGX4T-1-P7的western blot分析Fig.4 WesternblotanalysisofrecombinantproteinpEGX4T-1-P7

2.5 目的基因DNA测序结果及推导的氨基酸序列分析

将转化E.coli DH5α感受态细胞后提取质粒，送测序后，对鉴定正确的结果进行分析，分析显示BVDV P7相对分子质量17 589.3，部分基因cDNA长215 bp，理论pI值为5.37，编码71个氨基酸；分子式：C652H1090N216O278S37；半衰期体外4.4 h，体内大于20 h；不稳定系数50.90（不稳定）；总平均疏水指数0.633。说明该蛋白为疏水性蛋白。图5为目的DNA氨基酸序列。

图5 BVDV-1 P7基因cDNA序列及氨基酸序列Fig.5 The cDNA and amino acid sequence of P7 gene of BVDV-1

2.6 二级结构预测

二级结构包括α-螺旋（30 aa，42.25%）、β折叠（22 aa，30.99%）、β-转角（8 aa，11.27%）和无规卷曲（11 aa，15.49%）

2.7 P7基因信号肽预测

信号肽是指位于N端的负责新生肽链穿越粗糙内质网膜的这段肽链。在成熟的蛋白质中则不存在，大多数为氨基酸残基，长度约20～30个，整体来看是高度疏水的。如图6所示信号肽在线预测认为，P7基因有明显的信号肽。

图6 P7基因的信号肽预测Fig.6 Signal peptide prediction of P7 gene

2.8 P7基因的疏水性分析

P7蛋白亲水性最高分值为-1.444，疏水性最高分值为3.400，总的来说疏水性氨基酸较均多于亲水性氨基酸，整条多肽链表现为疏水性氨基酸，有四个明显的疏水性区域。由此推测P7属疏水性蛋白，与信号肽预测结果一致。

图7 P7基因的疏水性分析Fig.7 Hydrophobic analysis of P7 gene

3 讨论

BVD在世界上广泛性分布，是一种能够持续感染的严重的传染病，我国首次分离得到正确BVDV株在1983年，由李佑等人完成，该病对我国的牛群造成了极大的伤害，流行广泛。

依据5′UTR、Npro基因和E2基因序列可将BVDV分为2个基因型BVDV-1和BVDV-2[4]。该研究是BVDV-1型，包含P7蛋白。P7蛋白是一个病毒孔蛋白，明显的参与到猪BVDV病毒毒力的进程中。P7蛋白在大肠杆菌中的表达引起了细菌细胞的透化作用转化为小分子。同时P7蛋白能够提高哺乳动物细胞的膜渗透性，提高细胞内Ca2+的浓度，这种细胞的渗透性可以转化为潮霉素B的抑制剂。P7蛋白是膜内在蛋白，可以形成同源寡聚体[5]。在表达的早期阶段，主要集中在内质网，在晚期转移到细胞膜上表达。研究证明了BVDV P7蛋白拥有的性能通常都与病毒孔蛋白有联系，这是研究BVDV感染的治疗性干预发展的一个潜在的目标。

目前使用大肠杆菌表达系统是最广泛的表达系统之一。尽管与其他系统相比在大肠杆菌中表达的蛋白有易形成包涵体、缺少修饰、糖基化等一些缺陷，但该表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、抗污染能力强、培养周期短等优点。因此是基因工程研究中的重要工具之一[6]。由于上述原因，实验选择将BVDV P7融合蛋白表达在大肠杆菌E.coli中。研究选用了原核表达载体pEGX4T-1，是T7表达系统中的一员，表达体系选择大肠杆菌来表达P7基因，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹来分析重组P7蛋白表达后的反应原性。为了能够将重组蛋白实现高效表达，研究首先进行了预实验，通过对菌液的培养温度、诱导时间和诱导剂浓度条件的优化，使蛋白更高效的表达。在实验过程中，发现IPTG浓度对蛋白表达很重要，量低不足以使蛋白表达，量过高又会导致菌体代谢负荷过大；温度同样有影响，在高温条件下蛋白表达量降低，而低温又会影响到外源蛋白的合成；当诱导时间比较长时，包涵体积累过多，会使细胞受到损害，更严重的甚至会导致细胞的溶解，但是时间过短会造成外源蛋白表达较少。在多次交叉实验对比后验证后，最终选择来表达重组蛋白的最优条件为在42℃条件下，用1 mmol·L-1IPTG诱导菌液10 h能使蛋白产量达到较高水平。重组P7蛋白的成功能够为BVDV病毒孔蛋白机制的研究提供了理论依据。

4 结论

实验在BVDV P7基因的原核表达载体成功构建的同时，通过实验证实论了该重组蛋白在大肠杆菌中具有较强反应原性。同时对P7基因的生物信息进行分析，说明P7蛋白是一种疏水性蛋白，作为一种病毒孔蛋白，在病毒的装配和促进透化作用上起了重要作用。

［1］王嵩，林红丽，王宇鹏，等.牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（3）：26-29.

［2］郑杰，刘霜，罗斌，等.山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究［J］.西南民族大学学报：自然科学版，2015，41（6）：672-677.

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［4］张淑琴，谭斌，王凤雪，等.牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL分离株全基因序列测定与分析［J］.中国畜牧兽医，2014，41（10）：23-27.

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［6］刘昱成.牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆—表达及间接ELISA方法［D］.石河子：石河子大学，2011.

Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of BVDV P7 Protein

Li Tiantian，Zhai Junjun，Ni Hongbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319））

For prokaryotic expression of BVDV P7 gene and its bioinformatics analysis，RT-PCR method was used to amplify BVDV P7 gene which isolated from BVDV-1 NADL，then BamH I and Sal I were used to digest PCR products and this recovered fragment was inserted into the pEGX4T-1（+），a prokaryotic expression vector，to generate recombinant pEGX4T-1-P7.pEGX4T-1-P7 was transformed into E.coli BL21，using bioinformatics technology for bioinformatics prediction at the same time.The results showed that amplification was successful and the BVDV NADL strains of BVDV-1 P7 prokaryotic expression vector were built，named pEGX4T-1-P7.SDS-PAGE and Western blot showed that at expected size a molecular mass of 34 kDa appeared the expressed protein.The bioinformatics analysis by prediction software indicated that the signal peptide and hydrophobic site existed in P7 protein.It concluded that P7 protein was successfully expressed and it was a hydrophobic protein，which established solid foundation for the further study of its functions.

bovine viral diarrhea virus；p7 genes；prokaryotic expression；bioinformatics

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0069-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.014

2015-06-10

黑龙江省青年科学基金（QC2015031）；兽医生物技术国家重点实验室开放课题基金（SKLVBF201508）。

李田田（1991-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2014级硕士研究生。

倪宏波，男，教授，博士研究生导师，E-mail：nihongbo@sina.com。