不同基源党参种子冰冻切片技术探讨

刘 玉，柴俊雯，陈红刚，陆国弟，杜 弢*,2,3

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学药用植物遗传育种研究所，甘肃 兰州 730000）

不同基源党参种子冰冻切片技术探讨

刘 玉1，柴俊雯1，陈红刚1，陆国弟1，杜 弢*1,2,3

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学药用植物遗传育种研究所，甘肃 兰州 730000）

以不同基源的党参为试材进行冰冻切片，种子经过前处理、冷台固定、冷冻切片、展片、染色、观察并拍照等步骤，结果表明，当冷台温度为-20℃、OCT包埋剂冷冻5～8 min、切片厚度为8～12 μm时，可以获得较清晰的种子横（纵）切面图，切片组织完整性和图片清晰度效果较好。

党参；川党参；素花党参；种子；冰冻切片；技术

冰冻切片是一种在较低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法，且不经过脱水和透明、浸蜡等一系列的繁琐前期实验步骤，组织形态不会收缩，具有简便、快速、易操作、环境污染小等特点[1]。常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究，在动物和人体的研究、临床手术中已被广泛应用[2]，近年来也逐渐应用于药材的根、茎、花、果实和种子研究[3～5]。

本试验以不同基源的党参为主要试材，在最短时间内制作出高质量的切片，试图建立一种适合于党参种子快速、简便、高效的冰冻切片技术。

1 仪器与材料

1.1 仪器

德国产Leica-CM 1950型恒冷切片机；日本产Feather一次性刀片；尼康80i显微成像系统。

1.2 试剂

70%乙醇、1%番红水溶液、0.1%固绿乙醇溶液（95%乙醇配制）、95%乙醇、OCT包埋剂、普通胶水、载玻片、盖玻片、酒精灯、水合氯醛及50%甘油。

1.3 材料

党参（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）素花党参（Codonopsis pilosula Nannf.Var.modesta（Nannf.）L. T.Shen）和川党参（Codonopsis tangshen Oliv.）种子，均由甘肃中医药大学药用植物遗传育种研究所提供，经甘肃中医药大学杜弢教授鉴定。

2 方法与步骤

操作步骤：①前处理；②固定样品至冷台；③冰冻切片；④展片；⑤染色；⑥观察并拍照。

2.1 前处理

样品前处理比较了用水浸泡和不同浓度梯度的酒精浸泡对切片效果的影响，结果表明，两种处理方法对种子切片基本没有影响。考虑经济方面，将种子用清水洗涤3次后，置于室温下在水中浸泡12～24 h。

2.2 固定样品至冷台

设定冷冻切片机温度（-20℃），将试验用的毛笔、镊子放入冷冻切片机内一起降温。待温度降到-15℃以下时，用毛笔刷去除冷台上的薄霜。将刀片固定在切片机的刀槽上，当冷冻箱温度降低至-20℃时，将种子放在托盘上，然后滴加OCT包埋剂或胶水，用大头针使种子均匀地分散在包埋剂中。然后置于冷台上，OCT冷冻5～8 min或胶水冷冻20～30 mim，使材料迅速冷冻并能够牢固地黏附在托盘上。

2.3 切片

将托盘置于冷台固定槽上，调节旋转切片厚度的旋钮，摇动旋转手轮进行切片。切片不可太厚，否则细胞容易重叠而影响观察结果；也不可过薄，否则切片易碎、不完整。经过多次试验，将种子切片厚度调为8～12 μm，在切片的过程中，切片刀上的霜层较厚，应及时启动除霜程序去除霜层或者用毛笔刷刷掉，以防止卷片。

2.4 展片

用毛笔刷将切片移到载玻片上，或者直接将载玻片以合适的位置靠近刀片。由于温差作用，切片自动黏附在载玻片上。取出载玻片，进行形态学观察等后续试验。

2.5 染色

载玻片上的材料用质量分数为1%的番红水溶液染色20 min，用蒸馏水洗涤3～5次，再用质量分数为0.1%的固绿染色30 s，用质量分数为95%的乙醇冲洗固绿至材料不褪色为止，之后滴加质量分数为50%的甘油于材料表面，盖上盖玻片。

2.6 观察并拍照

使用尼康80i显微成像系统观察切片并拍照。

3 结果

3.1 党参种子微观特征

党参种子结构由种皮、胚乳和胚3部分组成，种皮细胞排列整齐，其表面纹理呈条型网状纹饰，网眼呈长条形或梭形。横切面：种皮为一列棕红色厚壁细胞，细胞呈柱状，相邻细胞间没有间隙；胚乳细胞多层，呈多角形作径向延长排列，内含较多的糊粉粒；胚位于中央，外层细胞呈长方形或近方形环状排列，靠近最里面呈径向排列（如图1中A党参种子横切显微结构）。纵切面：种皮细胞呈纵向长条形或梭形，细胞切向延长，壁孔纹增厚，胚乳多层，胚位于中央，呈长方形作径向排列。

3.2 素花党参种子微观特征

与党参种子结构及其相似。横切面：种皮表皮为一列棕红色厚壁细胞，细胞柱状；胚乳多层；胚位于中央。纵切面：种皮细胞呈纵向长条形或梭形；胚乳多层，呈多角形切向延长排列；胚位于中央，呈长方形作径向排列，种皮细胞呈纵向长条形或梭形（如图1中B素花党参种子纵切显微结构）。

3.3 川党参种子微观特征

与党参、素花党参种子结构及其相似，表面具有排列整齐的条型网状纹饰，网眼呈梭形或长条形。横切面：种皮为一列棕红色厚壁细胞，细胞柱状，外壁互相连接；胚乳多层，呈多角形作径向延长排列，内含较多的糊粉粒；胚位于中央，外层细胞呈近长方形或不规则方形环状排列，靠近最里面呈径向排列（如图1中C川党参种子横切显微结构）。纵切面：种皮细胞呈纵向长条形或梭形；胚乳多层，呈多角形切向延长排列；胚位于中央，呈长方形作径向排列。

图1 不同基源党参种子横（纵）切面显微结构图

4 结论与讨论

4.1 不同冰冻切片条件的比较

新鲜材料直接包埋冷冻切片的关键是既有适合切片的冷冻温度，又有最大程度减少冰晶形成的冷冻时间。为了得到适宜的冷冻温度和冷冻时间，在冷台温度为-15℃、-20℃、-25℃的条件下，冷冻不同时间（20～40 min），观察切片效果。通过反复比较发现，冷台温度-20℃、冷冻时间根据不同包埋剂冷冻时间不同、胶水作包埋剂一般冷冻25～30 min切片效果最好。若冷冻时间太短（20 min），因为组织本身较软，会因包埋剂和材料的硬度不一致，在切片时易产生空洞，造成胚丢失，从而影响成片；若时间太长（40 min），则会导致冰晶太多，细胞破损，故20～30 mim较为适宜。OCT包埋剂一般冷冻约5～8 min，时间过长也不利于切片。

4.2 包埋剂对切片效果的影响

冰冻切片常用的包埋剂有水、普通胶水和OCT，比较分析了这3种包埋剂对冰冻切片的影响，结果表明，用水作包埋剂，较难切出完整的切片，种子都集中到底部，且无法进行切片；OCT包埋剂与普通胶水效果基本相同，都能切出完整的切片，但用普通胶水必须用热水冲洗后才能染上色，否则无法染色，但由于种子本身小，用水冲洗几次就很难找到种子，且冲洗过程中种子容易碎；用OCT包埋后直接用水合氯醛透化染色再滴稀甘油盖上盖玻片后，就可以观察清楚种子组织结构。如果在冰冻前将材料浸没在OCT中，让OCT充分渗透进组织中，切片效果更好。

4.3 切片厚度对细胞形态的影响

经过多次试验，种子切片厚度为8～15 μm时，切片效果良好，厚薄均匀、无皱折，镜下组织结构完整、细胞形态清晰、无明显收缩、组织无人为裂隙、无空泡及空网状形成、无冰晶等。主要观察的组织结构能较完整地呈现，与石蜡切片观感相似，层次分明、分辨率良好。

综上所述，冰冻切片是植物细胞和形态结构研究的一种简便、快捷、高效的方法。笔者以不同基源的党参种子冰冻切片，取得了良好的效果。冰冻切片不易掌握，要做好一张冰冻切片不能只注重速度，其他步骤也很重要。

[1]包翠芬,刘霞,穆长征,等.冰冻切片几种防冰晶方法的比较[J].中国误诊学,2006，6(17):3 310-3 311.

[2]Irina G M,Michael M M,Louis G,Chung C,Michael V U.Decreased NPYinnervation of the hypothalamic nuclei in ratswith cancer anorexia[J].Brain Research,2003,961:100-108.NE.Bib

[3]陈丹,赵洁.适合于植物花器官的冰冻切片技术[J].武汉植物学研究,2005,23(3):285-290.

[4]刘剑锋,程云清,阎秀峰,等.植物冰冻切片技术的改进[J].南京林业大学学报(自然科学版),2006,30(3):128-130.

[5]李儒海,强胜.杂草果实的冰冻切片技术[J].植物学报,2010,45(6): 739-743.

1005-2690（2016）11-0112-02

：S567.5+3

：B

2016-06-24）

2012年中医药部门公共卫生专项“2012年国家基本药物所需中药原料资源调查和监测”（财社〔2012〕13号）课题“国家基本药物所需中药材种子种苗繁育基地建设”

刘玉（1991-），汉族，陕西榆林人，硕士，研究方向为中药资源开发与质量综合评价。

*

：杜弢(1967-)，汉，硕士，教授，主要从事药用植物育种、栽培的教学与研究。