提高饮用水“两虫”检测回收率的方法探讨——Filta-Max xpress快速法

提高饮用水“两虫”检测回收率的方法探讨
——Filta-Max xpress快速法

金幼平 徐 飞 绍兴市水环境科学研究院有限公司

本文对免疫磁分离荧光抗体法测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫过程中3个关键步骤——浓缩、分离和染色过程的加标回收率情况分别进行比对试验，对如何提高饮用水中“两虫”检测回收率提出合理化建议。

隐孢子虫；贾第鞭毛虫；免疫荧光；回收率

隐孢子虫和贾第鞭毛虫（简称“两虫”）是严重危害水质安全的病原性原生动物，由于其对于通常的氯消毒过程具有较强抗性，因此《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）中首次将“两虫”检测项目列入其中。由于方法的特殊性，标准中规定两虫检测回收率合格标准最低仅为10%。为掌握检测要点，切实提高检测技能，对“两虫”检测过程中的关键步骤进行分步加标回收率测试，对影响回收率的因素进行探讨，并提出稳定和提高回收率的合理化建议。

1 材料与方法

1.1 材料

环城河水，含0.1%活性炭水样；G-C质控标样、免疫磁分离试剂盒（Dynal）；免疫荧光试剂盒（Waterborme）；Fiha-Max xpress快速 淘 洗 设 备；Hettich Rotanta 460离心机。

1.2 试验方法

按照《生活饮用水标准检验方法微生物指标》（GB/T 5750.12-2006）[1]中5.1.4.1.2的方法，分别对离心、掏洗、酸化分离步骤的分步回收情况进行测试。

①用高浊度水样（环城河水、活性炭混悬液）代替洗脱液测定Hettich Rotanta 460离心机离心效果，并对离心后抽取的上清液进行二次离心。②将G-C质控样直接加入到装有450 mL淘洗缓冲液的离心管中进行加标回收率的测定。③对加标水样的过滤模块连续淘洗两次，分别测定两次淘洗的回收率。④测定免疫磁分离阶段加酸分离时两次加酸的分步回收率。⑤测定整个免疫磁分离阶段的回收率。⑥测试染色时间对检测值的影响。

2 试验结果

2.1 离心机离心效果的评价

无制动减速后沉淀物在离心管中的分布情况如图1、图2所示。离心后沉淀物多集中在离心管的锥形部分，但河水离心后沉淀基本集中在锥尖部分（图2）而活性炭混悬液的大量沉淀均匀贴在整个锥形部分（图1）。因此，在检测过程中为最大限度地避免对管壁沉淀物的扰动，在吸取上清液时，应把真空吸液装置的吸液管管尖尽可能放在离心管的中心部位，不应贴到管壁上。

图1 活性炭混悬液

图2 环城河水

二次离心的回收率见表1。从检测数据看，一次离心已能达到加标回收率的要求（10%～100%），增加离心次数一定程度上能提高回收率，但同时直接成本将提高50%左右。实际工作中必要时建议适当增加离心时间，以达到提升离心效果的目的。

将G-C质控标样直接加入到离心管中，测得的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的回收率分别为0%、3%，远低于平均加标回收率。具体原因不明确，不排除杂质过少不利于卵囊和孢囊沉降的可能性。

2.2 压力淘洗装置洗脱效果的考证

二次淘洗的检测结果见表2。从检测数据看，二次淘洗的效果与二次离心的情况类似。另外，由于该步骤基本是按照设定程序由仪器自动操作完成的，因此，在回收率能够满足标准要求的情况下，不建议轻易改动内置参数。

2.3 免疫磁分离阶段影响因素的观察

2.3.1 酸解离效果的观察

自来水加标样品免疫磁分离阶段两次酸解的回收率测定结果见表3。结果表明，一次酸解分离不能确保分离效果，尤其是贾第鞭毛虫，第二次加酸回收率远高于第二次，可见为提高和稳定回收率，样本进行二次加酸分离很有必要。

2.3.2 免疫磁分离过程加标回收率的测定

将G-C质控标样直接加入到装有10 mL缓冲液的L形管中，进行回收率的测定，测得隐孢子虫和贾第鞭毛虫的分步回收率分别为70%；79%，基本能满足回收率的要求。

2.4 染色时间对镜检效果的影响

对一个由典型加标样本处理后获得的井形玻片进行FITC染色时，控制不同的湿室孵化时间，第一次为37℃、30 min；镜检后，37 ℃继续染色40 min，再次镜检，比较两次镜检的情况，可以明显感觉到延长染色时间后，卵囊和孢囊的荧光强度均有不同程度的增加，且外形特征更加典型（图3，图4），且计数结果有了细微的增加，特别是质控标样保存时间偏长时效果更为明显。

表1 加标样二次离心检测结果

表2 加标样两次淘洗检测结果

表3 加标样两次酸解检测结果

3 结论

图3 蓝色滤光片

图4 紫外滤光片

分步试验结果及实际检测经验表明，在熟悉操作技能的基础上，通过采取一些措施并注意操作要点将有利于提高和稳定两虫检测的回收率，包括：①适当延长淘洗液的离心时间，并且在吸取上清液时尽量把真空吸液装置的吸液管管尖放在离心管的中心部位，避免被管壁上偶然堆积的细小沉淀物的干扰。②在免疫磁分离阶段采用两次酸解分离。从节约检测成本角度考虑，可把两次酸解获得的酸解液加到同一个井形玻片中进行计数。③在对样品进行FITC染色时，可适当延长湿室孵化的时间。经验表明，采用37 ℃，60 min或更长一些的时间，更有利于观察和提高回收率，尤其是对于保存时间偏长的质控样效果更加明显。

[1]中华人民共和国卫生部.生活饮用水标准检验方法 微生物指标(GB 5750.12-2006)[S].北京:中国标准出版社,2006.