家蚕彩色蚕中红色素和丝心蛋白相互作用的研究

章玉萍 陈 明 张丽丽 代君君 吴传华 刘 健 范 涛

(安徽省农业科学院蚕桑研究所,安徽合肥 230061)

家蚕彩色蚕中红色素和丝心蛋白相互作用的研究

章玉萍 陈 明 张丽丽 代君君 吴传华 刘 健 范 涛*

(安徽省农业科学院蚕桑研究所,安徽合肥 230061)

为探讨茧色的形成机理，对红色蚕及其茧、丝腺进行解剖观察，然后测定丝心蛋白的氨基酸组成和含量，最后应用光谱法测定红色素和家蚕丝心蛋白之间的相互作用。结果显示：红色素在丝腺中全部着色，前部、中部、后部丝腺及吐丝管都完全着色，白蚕和红蚕丝心蛋白组分及含量的变化基本相同，丝心蛋白上的酪氨酸残基参与了猝灭过程，结合作用为氢键结合。

彩色蚕 丝心蛋白 氨基酸 相互作用

家蚕茧色丰富多彩，是其他绢丝昆虫所不及。尽管目前的饲养品种几乎全为白茧，但家蚕有许多较原始的有色茧品种，这都是自然突变而形成的。目前，国内研究机构保存的家蚕茧色突变型主要有黄红茧系和绿茧系两大类[1-2]，茧丝的颜色种类及深浅不仅受到色素生成及运输的基因的控制，更与这些色素的成分和含量有关[3-5]。利用色素添食技术生产家蚕彩色茧是在家蚕常规饲养的基础上，在桑叶中添加色素，使蚕食后改变其绢丝腺的着色性能，根据添食色素的不同呈现各种色彩，该技术居国内首创、达到国际先进水平[6-8]。利用色素添食技术生产的彩色茧可解决天然彩色茧颜色种类少的问题，但在实验中发现该技术生产的彩色茧存在着“着色度不均、蚕体损失”等问题，正是由于色素在蚕体中是如何转运吸收，色素和丝胶、丝心蛋白的相互作用等茧色形成的机理不明确限制了其生产。

近年来关于彩色茧的形成机理国内外学者进行了相关研究，并报道了有关色素结合蛋白在蚕体内转运的重要作用[9]。Feltwell、Kayser 等[10]报道了载脂蛋白在转运β-胡萝卜素、叶黄素从血淋巴到中部丝腺过程中丢失β-胡萝卜素的情况，推测可能是膳食中的类胡萝卜素在被鳞翅目昆虫吸收、储运过程中经过修饰所致。Tabunoki 等[11]在家蚕黄茧品种的丝腺组织中分离纯化出的一种类胡萝卜素结合蛋白(CBP) ，并对其进行了cDNA 的序列分析。目前关于利用色素添食法生产彩色茧的机理研究很少报道。本文通过研究家蚕中色素与丝心蛋白之间的相互作用，探索研究彩色茧的形成机理，希望能为今后家蚕彩色茧的大规模研制提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与试剂

日立氨基酸分析仪L-8900，离子交换柱：4.6 mm ×60 mm填料为3μm磺酸型阳离子树脂分离柱，交换树脂型号：No.2622(日本公司生产的氨基酸分析专用树脂)。真空干燥箱，FA1204N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，氨基酸分析仪配套的流动相(缓冲液和茚三酮溶液)。牛磺酸对照品，sigma公司提供，纯度 99%；其他氨基酸由氨基酸分析仪的仪器商提供。RF-540 荧光分光光度计(日本岛津)；UV-265 紫外可见分光光度计(日本岛津)；pHS-3C 型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)；CS501 型超级恒温水浴(南通科学仪器厂)。MilliQ超纯水仪。一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒、改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒、酸性红、Tris-HCl(上海生工生物股份有限公司)。实验所用试剂均为分析纯，实验室用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 彩色蚕饲养

菁松×皓月幼虫期采用三回育(7：30/14：30/20：30)温湿度标准进行饲育，五龄第二天开始利用色素添食法生产彩色蚕茧[12]。

1.2.2 家蚕丝腺着色观察

在添食色素后的第一天，每24 h解剖1次蚕体观察丝腺的变化，之后每天记录1次蚕体体色和绢丝腺的变化，收集彩色茧，并调查彩茧着色情况。

1.2.3 丝心蛋白的提取及浓度测定

取五龄6～7 d的桑蚕幼虫，将成熟幼虫的丝腺取出，切下后部丝腺，用预冷的pH 7.0 的PBS洗数次，再放入冷的蒸馏水中，收集透明的丝心蛋白，放入-20℃冰箱中保存备用。 用“一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒”提取丝心蛋白，提取步骤依照说明书操作。利用“改良型BCA法蛋白浓度测定试剂盒”测定丝心蛋白浓度，根据下表制定蛋白标准曲线。

表1 蛋白标准曲线制定

1.2.4 丝心蛋白氨基酸测定

称取 45.1 mg 试样，以 6 mol/L HCl 20 mL 溶解，氮气保护 110℃酸水解 22 h，冷却后转移至 25 mL容量瓶，定容。取 1 mL 55℃氮气吹干，加入 1 mL蒸馏水再烘干，反复3次。用去离子水(0.02 mol/L HCl)2 mL充分溶解，混匀。用 0.45 μm 滤膜过滤，进样 20 μL上机测试。

1.2.5 色素与丝心蛋白相互作用研究

在10 m L比色管中依次加入1.0 m L pH 7.40 Tris-HCl缓冲溶液，1.0 m L 1.0×10-5mol/L 丝心蛋白溶液，分别加入浓度为1.0×10-4mol/L 红色素0 mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀、恒温(298 K)放置约20 min，在狭缝宽度为10 nm，荧光激发波长280 nm，发射波长344 nm分别绘制相应的荧光光谱和测定荧光强度。同时以不含色素的丝心蛋白溶液荧光强度为对照，探讨红色素对丝心蛋白的荧光猝灭作用。

2 结果与分析

2.1 家蚕蚕茧丝腺着色观察

结果如图1所示：红种色素成功在丝腺着色并结成红色茧，在添食色素的过程中，蚕体都被桑叶上的色素染成红色蚕，但蚕儿一切行为都正常。所有的有色茧都色泽均匀、颜色鲜艳。色素在丝腺中全部着色，前部、中部、后部丝腺及吐丝管都完全着色。证明色素分子已进入丝素。

2.2 家蚕丝心蛋白氨基酸组成和成分含量

氨基酸分析仪测定结果表明：白色蚕和红色蚕心蛋白的氨基酸组成几乎相同，有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、笨丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和色氨酸等17种氨基酸。主要的组成氨基酸都是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸等4种氨基酸。白蚕丝心蛋白中甘氨酸∶丙氨酸∶丝氨酸∶酪氨酸为：35.83∶24.87∶8.96∶4.1，此4种氨基酸占总氨基酸含量的73.8%；红蚕丝心蛋白中甘氨酸∶丙氨酸∶丝氨酸∶酪氨酸为：32.95∶23.56∶8.16∶4.19，此4种氨基酸占总氨基酸含量的69.31%。

表2 2个蚕品种丝心蛋白氨基酸组成分析结果

2.3 家蚕丝心蛋白浓度测定

制定蛋白标准曲线，相关系数为0.99843，达到了实验标准。根据蛋白标准曲线，测定提取的家蚕丝心蛋白浓度约为50 mg/mL。

2.4 色素与丝心蛋白相互作用

色素—丝心蛋白溶液的荧光猝灭光谱见图3。

从图3可以看出，丝心蛋白的荧光发射强度随着色素浓度的增加而降低，证明色素分子对丝心蛋白具有良好的荧光猝灭作用。通过猝灭常数计算，表明色素分子对丝心蛋白的猝灭反应是静态猝灭过程，结合作用为氢键结合。猝灭曲线显示丝心蛋白上的酪氨酸残基参与了猝灭过程，因此推断是富含酪氨酸残基的丝心蛋白重链晶性结构域参与了与色素分子的结合过程。

3 小结与讨论

本研究首先通过解剖家蚕观察发现色素在丝腺中全部着色，前部、中部、后部丝腺及吐丝管都完全着色，证明色素分子已进入丝素，证明色素已和丝心蛋白结合在一起；然后通过日立氨基酸分析仪测定了白蚕和红色蚕丝心蛋白的氨基酸组成及含量，结果二者氨基酸组成几乎相同，主要的组成氨基酸都是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸等4种氨基酸，且白蚕丝心蛋白四种主要氨基酸的比例和以前的研究结果相似。

研究表明，蚕丝的形成可以分为三步：合成分泌蚕丝蛋白，蚕丝蛋白在丝腺腔中的浓缩，蚕丝喷吐及牵拉[13-14]。丝心蛋白在蚕丝形成中经历三种状态：凝胶到溶胶状态转变，溶胶到液晶状态转变，液晶态到纤维丝态转变[15]。丝心蛋白主要有三种蛋白组成：丝心蛋白重链(Fib-H chain)[16]、丝心蛋白轻链伍(Fib-L chain)及糖p25[17]。研究Fib-L chain和P25都具有糖基化位点，通过非共价键相互作用，Fib-H chain和Fib-L chain组成复合体与P25结合一起[18]。已有的文献证明，Fib-H上有丝心蛋白和小分子结合的位点。重链氨基酸分为两类：由重复氨基酸序列(Gly-X，X是Ala占65%，Ser占23%，Tyr占9%)组成的晶性结构域和非定形区。晶性结构域含有60-70个氨基酸组成的亚结构域，二级结构上呈现一个空腔结构。根据荧光猝灭结果我们推测这可能是丝心蛋白和色素分子的结合位点。随着生物高新技术的快速发展，彩茧不仅可应用于服装纺织业，还可广泛应用于医疗、食品、工业等多个领域。本次试验为今后彩色茧的成色机理研究奠定了一定的基础。

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Interaction between Red Pigment and Fibroin in Natural Colored-cocoon Strains of Bombvx mori

ZHANG Yuping，CHEN Ming，ZHANG Lili，DAI Junjun，WU Chuanhua，LIU Jian，FAN Tao*

(Sericultural Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences,230061,Hefei ,Anhui, China)

To explore the formation mechanism of cocoon color, the red silkworms were taken to do anatomical observation on their cocoons and silk glands, and then determine the content and amino acid composition in fibroin, finally investigate the interaction between red pigment and fibroin. The results show red pigment was fully colored in silk gland, including the front, middle and hind parts as well as the spinneret. The white silkworm and red one have basically the same composition and content of fibroin, and the tyrosine in fibroin plays a great role in quenching process, while the interaction was hydrogen bonding.

colored-cocoon; fibroin; amino acid; interaction

* 资助项目：安徽省农科院创新团队建设项目(15C0606)；现代农业产业技术体系建设专项(CARS-22-SYZ09)；安徽省蚕桑产业技术体系项目(ahnycytx-16)

章玉萍(1981-)，女，博士，副研究员，从事经济昆虫资源综合利用方面研究。

范涛(1962-)，男，硕士，研究员。E-mail: fantao116@sohu.com