酶解血粉的单因素和响应面条件的优化

■王 燕 易春霞 文奇男 刘 骥 郭建华 任 健 郭宏文 刘晓兰

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁沈阳110036）

随着酶技术的迅速发展和酶产品的增多，利用蛋白酶水解猪血以提高其利用率得到了关注[1]，酶解处理后得到酶解液中含有多肽和小肽，这些肽成分容易被动物吸收，且肽本身具有很好的抗氧化、免疫促进及抗菌特性等作用。可供选择水解猪血的蛋白酶种类也多，有中性蛋白酶[2-4]、木瓜蛋白酶[3，5]、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶[2，6-7]、胃蛋白酶、胰酶[8]、复合酶[3，9]。李艳伟[9]用胰蛋白酶水解猪血得到提纯小肽，通过体内和体外的免疫活性实验证明小肽对免疫活性有显著的增强作用。郭奇亮[10]利用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶作为水解用酶来酶解猪血红蛋白得到的多肽具有很好的降血压效果。张凤英[11]利用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶来酶解血球粉得到的酶解产物具有很好的抗氧化作用。酶解处理后蛋白的二级结构会发生改变，导致功能特性的变化，动物利用效果提高。施用晖等[12]利用制备得到的消化酶酶解血粉替代鱼粉，也发现酶解血粉和鱼粉对肉仔鸭有相同的饲喂效果。周学文等[13]报道，木瓜蛋白酶酶解血粉替代肉鸡和小白鼠日粮中的秘鲁鱼粉，结果显示，肉鸡和小白鼠增重情况相似，说明酶解猪血粉的饲养价值优于秘鲁鱼粉。但是酶解血粉的水解度较低，小肽含量低，血粉的利用率仍较低，如何通过提高血粉的水解度，从而提高血粉的利用率成为亟待解决的问题。本试验的目的是筛选水解血粉的最有效的酶制剂，利用筛选得到的酶制剂产品，通过单因素和响应面实验探讨酶解工艺的最佳参数。

1 材料与方法

1.1 材料

选用干燥血粉作为实验原料，首先进行除毛处理，再进行粉碎过40目筛备用。

1.2 方法

首先筛选最佳酶（中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶），再选择最佳的酶，研究用最佳工艺条件酶解后的血粉的水解度，优化的工艺条件包括底物浓度、酶添加量(E/S，酶与底物比)、pH值、温度和水解时间，再选用影响较大的4个因素进行响应面实验，选出最佳的工艺条件。

1.3 水解度的测定

取灭酶后水解液，经过一定程度的稀释，取2 ml稀释液于试管中，加入1 ml茚三酮显色剂，混匀后置沸水浴加热15 min，冷水冷却，加入5.0 ml体积分数为40%乙醇溶液充分混匀，放置15 min后，于570 nm处测定光密度值（去离子水做参比）。另取相同浓度未水解蛋白溶液1.0 ml，按照上述方法测定光密度，以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白质质量浓度，其水解度根据以下公式进行计算：

式中：h——水解打开的肽键个数；

htot——蛋白总肽键个数。

2 结果与分析

2.1 筛选最适宜的蛋白酶（见图1）

通过图1可以看出，碱性蛋白酶水解血粉的水解度最佳，达到8.95%，其次是中性蛋白酶和复合蛋白酶，最低的是风味蛋白酶和酸性蛋白酶。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 底物浓度对水解度的影响（见图2）

由图2可知，水解度随着底物浓度的增加呈现开始稳定后逐渐增加，达到最高点后又下降的趋势。由图2可知，底物浓度达到40 mg/ml时，水解度达到最高。

2.2.2 酶添加量（E/S）对水解度的影响（见图3）

图1 不同蛋白酶水解血粉的水解度

图2 不同底物浓度对血粉的水解度的影响

图3 不同酶添加量（E/S）对血粉的水解度的影响

由图3可知，随着酶添加量的增大，水解度呈现先稳定再逐渐增大的趋势。在反应初期，随着酶添加量的增加，水解度基本稳定。随着反应的进行，酶添加量逐渐增加，水解体系中的反应速率增加，提高了血粉蛋白的水解效果。但是酶的价格昂贵，因此，基于经济方面考虑，未添加更多酶以增加水解度。

2.2.3 pH值对水解度的影响（见图4）

图4 不同pH值对血粉的水解度的影响

从图4可知，碱性蛋白酶在pH值为11时的水解度达到最大，本试验中，蛋白酶酶解血粉蛋白的最适pH值符合碱性蛋白酶产生作用的pH值范围。

2.2.4 温度对水解度的影响（见图5）

图5 不同温度对血粉的水解度的影响

图5可见，随着温度的升高，蛋白酶的水解反应变慢，说明45℃为该碱性蛋白酶的最适温度。当达到最高值之后，随着温度的升高，水解度下降。由图5可知，碱性蛋白酶在45℃左右达到最大的水解度。

2.2.5 水解时间对水解度的影响（见图6）

从图6可知，随着时间的延长，蛋白酶酶解血粉蛋白的水解度增大，但是从经济和能耗的角度考虑，碱性蛋白酶的酶解时间确定为14 h。

2.3 响应面多因素工艺条件优化

2.3.1 响应面分析因素的选取及实验结果

根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，选取影响水解度较大的4个因素（底物浓度、温度、酶添加量及时间），以水解度为响应值，在单因素实验的基础上设计了4因素3水平的响应面分析实验。各因子及水平编码如表1所示。

图6 不同时间对血粉的水解度的影响

表1 实验设计因素水平及编码

2.3.2 模型的建立与显著性检验

利用Design-Expert软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合，可得底物浓度、温度、酶添加量及酶解时间与水解度间的二次多项回归方程：

式中：Y——水解度(%)；

A——底物浓度(mg/ml)；

B——温度(℃)；

C——酶添加量；

D——时间(h)。

响应面结果的方差分析和二次回归方程的方差分析分别如表3和表4所示。由表3、表4可知，本实验所选用模型极显著(P=0.004 8＜0.05)，失拟项不显著(P=0.187 7＞0.05)，说明模型的拟合检验显著；水解度的变异系数CV为6.78%，信噪比为9.181，说明模型可信度较高，模型校正相关系数为0.624 8，存在显著性差异，表明该模型拟合度良好；回归方程的复相关系数为0.812 4，表明81%的水解度的变化可由此模型解释，与实际情况拟合很好，所以此模型可应用于血粉水解度的分析和预测。

表2 Box-Behnken实验设计及水解度的预测值与实际值

表3 响应面结果方差分析

表4 二次回归方程的方差分析

由表3响应面结果方差分析可知，因素D在ɑ=0.01水平上对水解度的线性效应高度显著，因素D对曲面效应高度显著，说明水解时间对水解度的影响高度显著。因素BC在ɑ=0.05水平上的交互作用显著，因素C2对其曲面效应显著，说明酶添加量对血粉水解度有显著性影响，酶添加量与温度之间的交互作用也能对水解度造成显著性影响。由响应面方差分析的结果可知，在本实验范围内，对血粉水解度影响最大的是酶解时间，其次是温度和酶添加量，最后是底物浓度。

2.3.3 酶解条件的分析及优化

采用Design-Expert8.0.6软件对回归模型进行分析，酶解时间、温度、底物浓度和酶添加量对血粉水解度的影响的响应面图和等高线图见图7～图12。通过响应面图，可以直观地反映酶解条件对水解度的影响。等高线的形状可以反映出因素之间交互效应的强弱，圆形表示两因素不显著，而椭圆则表示较为显著。

图7 温度和底物浓度对水解度的影响的曲面图和等高线图

图8 底物浓度和酶添加量对水解度的影响的曲面图和等高线图

图9 底物浓度和酶解时间对水解度的影响的曲面图和等高线图

图10 酶解温度和酶添加量对水解度的影响的曲面图和等高线图

图11 酶解温度和酶解时间对水解度的影响的曲面图和等高线图

图12 酶解时间和酶添加量对水解度的影响的曲面图和等高线图

图7显示了底物浓度和温度的交互作用对硫甙降解率影响的等高线和曲面图。对其等高线图进行分析，可以直观地看出底物浓度和温度之间的交互作用显著，由曲面图可知，在本实验水平范围内，随着底物浓度的增大，水解度先增大后减小，当添加量为40 mg/ml附近时达到理论最大值；温度对水解度的影响与底物浓度对水解度的影响相一致，当温度为45℃附近，底物浓度在40 mg/ml时，水解度达到最高。

图8显示底物浓度和酶添加量的交互作用对水解度的影响。随着酶添加量和底物浓度增加，水解度先增加后下降，说明二者交互作用对水解度有影响，且酶浓度影响比底物浓度对水解度的影响大。

图9显示底物浓度和酶解时间的交互作用对水解度的影响。随着底物浓度增加和酶解时间的延长，水解度呈先增大后降低的趋势，当底物浓度为48 mg/ml时，水解度降幅较大，说明底物浓度和酶解时间对水解度有显著影响。

图10显示了底物浓度和温度的交互作用对硫甙降解率影响的等高线和曲面图。对其等高线图进行分析，可以直观地看出底物浓度和温度之间的交互作用显著，由曲面图可知，在本实验水平范围内，随着底物浓度的增大，水解度先增大后减小，当添加量为40 mg/ml附近时达到理论最大值；温度对水解度的影响与底物浓度对水解度的影响相一致，当温度为45℃附近，底物浓度在40 mg/ml时，水解度达到最高。

图11显示了酶解温度和酶解时间的交互作用对水解度的等高线和曲面图。对其等高线图进行分析，可以直观地看出酶解温度和酶解时间的交互作用显著，由曲面图可知，在本实验水平范围内，随着酶解温度的增加，水解度先增大后减小，当酶解温度为45℃附近时达到理论最大值，酶解时间对水解度的影响与温度对水解度的影响相一致，当温度为45℃附近，酶解时间为12 h，水解度达到最高。

图12显示了酶添加量和酶解时间的交互作用对水解度影响的等高线和曲面图。对其等高线图进行分析，可以直观地看出酶添加量和酶解时间的交互作用显著。由曲面图可知，在本实验水平范围内，随着酶添加量的增大，水解度先增大后减小，当酶添加量为0.780附近时，达到理论最大值，随着温度增加，水解度先增大后减小，当温度为42℃附近，水解度达到最高。

为了进一步求得各因素的最佳条件组合，由图7～图12回归方程的三维响应面图以及等高线图可知，回归模型存在最大值，当响应值Y有最大值时，对回归方程求一阶偏导数，得出酶解的最佳条件为底物浓度为41.44 mg/ml，温度为45℃，酶添加量为0.803 4，酶解时间为14 h，此时水解度达到了16.39%。

2.3.4 模型验证实验

为了验证模型的有效性，根据优化试验所得的各因素优化值，底物浓度为41.44 mg/ml，温度为45℃，酶添加量为0.803 4，酶解时间为14 h，重复3次试验，测得的水解度平均值为16.58%。与理论预测值16.39%非常接近，相对误差为1.93%，可见该模型能较好地预测酶解情况。由此说明响应面分析法应用于酶解条件的优化是可行的。该优化条件下水解度比优化前提高了3.11%。

3 结论

①酶解血粉的最优条件为：酶解的最佳条件为底物浓度为41.44 mg/ml，温度为45℃，酶添加量为0.803 4，酶解时间为14 h，此时水解度达到了16.39%。

②通过验证试验，测得血粉的水解度为16.58%，与理论预测值相比，相对误差仅为1.93%，说明模型能较好地预测酶解血粉的实际情况，具有较强的生产指导意义。