响应面法优化纤维素酶提取黄粱木叶蛋白工艺

■谢艺潇 王 雨 杨富裕*

(1.中国农业大学动物科技学院，北京100193；2.北京助尔生物科学研究院，北京100085)

由于世界蛋白资源匮乏，人类正在努力通过昆虫、藻类、植物叶片等多种途径获取蛋白质[1]。叶蛋白（Leaf protein concentration，LPC）是将新鲜的植物茎叶压榨取汁，将汁液中蛋白质分离、干燥后得到的高质量浓缩物[2]，是世界上最大的蛋白质来源[3]，其营养全面，富含多种活性因子，还具有一定的保健作用[4]。黄粱木在1972年的世界林业大会上被誉为“奇迹之树”，以生长快著称。黄粱木叶量大，蛋白含量较高，对其进行叶蛋白提取具有极大的开发价值。目前木本植物叶蛋白提取研究以蛋白桑、辣木为主，鲜有用黄粱木提取叶蛋白的研究报道，曾凡枝等[5]曾用纤维素酶对苜蓿进行浸泡处理提取叶蛋白。朱天明等[6]和熊瑶[7]则分别用纤维素酶对桑树叶粉和辣木叶粉进行处理，提取叶蛋白，三者均取得了较好的效果，表明纤维素酶对植物细胞壁有一定的降解作用，从而可以提高叶蛋白的提取率。但是曾凡枝等先用纤维素酶处理叶片后再进行打浆，这种工艺可能会阻碍纤维素酶对叶片内部细胞壁的降解，而朱天明和熊瑶等用干粉提取叶蛋白的方法在实际工业生产中会增加烘干成本。因此本试验采取先打浆再酶解的工艺，研究纤维素酶对新鲜黄粱木叶片叶蛋白提取工艺的影响，运用Box-Behnken试验设计原理和响应面分析法，得到纤维素酶活性范围内提取叶蛋白的最佳提取工艺，为更好地开发黄粱木叶蛋白资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

纤维素酶：活性≥10 000 U/g（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

1.2 试验植物

试验黄粱木叶片于2016年12月取自中国华南农业大学校园，经测定叶片含水量66.4%，粗蛋白含量11.9%。

1.3 试验设计

1.3.1 黄粱木叶蛋白提取工艺

称量新鲜采摘黄粱木叶片12 g，按照料液比1∶6加入1%NaCl溶液72 g，打浆4 min。在得到的叶浆中加入纤维素酶，恒温水浴2 h后用四层纱布过滤得到叶汁。叶汁80℃水浴10 min后，置于离心机6 000 r/min离心20 min。倒去上清液（棕色液）后将得到的叶蛋白置于65℃烘箱恒温干燥48 h，称重。

1.3.2 提取率的计算

用凯氏定氮法测定叶蛋白中蛋白质含量，按照下式计算提取率：

粗蛋白质提取率=叶蛋白中粗蛋白质含量/试样中粗蛋白质含量。

1.3.3 响应面试验设计

纤维素酶的反应温度一般为30～60℃，pH值4～5.5，文献显示其最适反应条件为温度45℃[8]，pH值5[5]。考虑到过高的温度可能导致叶蛋白提前沉淀，缩小温度试验温度范围至40～50℃。采用软件Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken试验设计原理，以加酶量、温度和pH值为自变量，以叶蛋白提取率为响应值设计试验，见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平

1.3.4 数据处理

数据处理与分析采用Design-Expert 8.0.6软件进行，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 数学模型的建立与显著性分析

Box-Behnken试验设计得到的结果见表2。应用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行多元回归分析，得到黄粱木叶蛋白提取率与酶法处理各因素编码值之间的二次方程模型：

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果

回归方程的方差分析和显著性检验结果见表3。

模型P=0.000 2＜0.05，失拟项P=0.445 3＞0.05，说明模型回归显著失拟不显著，复相关系数的平方R2=97.04%，说明预测值与实际值之间有较高的相关性，依照方程预测纤维素酶法提取黄粱木叶蛋白结果较可靠。在各因素水平范围内，对叶蛋白提取率影响大小排序为：pH值＞温度＞加酶量，方程中主因素B（pH值）对叶蛋白提取率影响显著，AC、A2、B2对叶蛋白提取率影响极显著，表明各个因素和响应值间不是简单的线性关系，交互项和二次项对黄粱木叶蛋白提取率也有影响。

2.2 提取工艺的响应面分析与优化

根据回归方程作响应面分析图，结果见图1～图3。可根据等高线的密集程度判断因素间交互作用的强弱，等高线为椭圆形说明交互作用显著，等高线密集说明响应值对因素数值变化更加敏感。如图2等高线较为密集，说明温度和加酶量的交互作用对黄粱木叶蛋白提取率有显著影响。由软件分析得，当pH值为4，温度为50℃，纤维素酶浓度为11.93 U/g时，黄粱木叶蛋白提取率理论值可达30.26%，经验证实际可达29.88%，接近理论值。

表3 模型回归系数显著性检验结果

图1 加酶量和pH值对提取率的影响

图2 加酶量和温度对提取率的影响

图3 温度和pH值对提取率的影响

3 讨论

本试验通过响应面分析在保证纤维素酶活性的条件下得到了提取黄粱木叶蛋白的最佳工艺，此时的提取率达到最大。同时在纤维素酶的作用下，黄粱木叶片细胞壁纤维素、木质素也被分解，从而可以提高棕色液中可溶性糖的含量，在当pH值为4，温度为45℃，纤维素酶浓度为30 U/g时，可溶性糖含量可达4 528.547 mg/kg。将棕色液和叶渣混合发酵产乙醇[9]或者用作饲料都是叶蛋白提取后副产品的有效利用方式，纤维素酶对纤维素、木质素的水解将对棕色液的利用起到有利影响。

但是，由于酶解时加酸的影响，可能导致打浆后浸出的蛋白质部分沉淀，被纱布滤走，从而造成了部分蛋白损失，这是本试验目前无法避免的一个缺点，不过并不影响得到的优化条件。本试验得到的研究结果可为黄粱木叶蛋白提取工艺开发提供了一定的理论基础和参考价值，但保持纤维素酶活性在另一方面可能限制叶蛋白的提取条件，因此本试验响应面优化所得到的最优条件也存在边缘水平，这在将来实际生产中应有所取舍，可以扩大范围进一步优化提取条件。

4 结论

在纤维素酶法提取黄粱木叶蛋白试验中，温度、纤维素酶浓度对叶蛋白提取率无显著影响(P＞0.05)，pH值对叶蛋白提取率影响显著(P＜0.05)，最优提取工艺为纤维素酶浓度为11.93 U/g，温度为50℃，pH值为4，提取率达29.88%。