生猪养殖场仔猪白痢大肠杆菌分离、鉴定及药物敏感性试验

■ 杨作丰 宋淑英 高 锋 刘耀川* 邓文超 张皓淳

（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164；2.辽宁省重大动物疫病应急中心，辽宁沈阳110161；3.辽宁益康生物股份有限公司，辽宁辽阳111000）

大肠杆菌为一种人兽共患的环境常在菌，目前已确定170多种不同血清型的大肠杆菌[1-2]。其中致病性大肠杆菌能够产生毒素及黏附因子，引起多种疾病。大肠杆菌为仔猪白痢的主要病原菌，该病多发于10～30日龄的仔猪中，病猪多排白色粪便[3]。该病在仔猪间快速传播、连续发病，发病时间较长的仔猪易形成僵猪。未及时治疗的病猪最终因严重腹泻，导致其他继发性疾病而死亡[4-6]。仔猪白痢为仔猪常发疾病，耐过仔猪生长缓慢，饲料转化率下降，给生猪养殖业打来巨大经济损失[7]。

目前，抗菌药物治疗仍是临床仔猪白痢的首选治疗方案。但随着抗菌药物，特别是广谱类抗菌药物的大量使用，使许多病原菌对抗菌药物产生了不同程度的耐药性，特别当人兽共患病原菌获得高水平耐药性后，不仅对养殖业造成危害，更给人类健康及公共卫生安全造成挑战[8]。本试验对沈阳某规模化生猪养殖场白痢仔猪进行致病性大肠杆菌分离、鉴定及药物敏感性试验，为该场仔猪白痢治疗筛选敏感治疗药物，并为病原菌耐药性研究提供基础。

1 材料

1.1 受试仔猪

于沈阳某规模化生猪养殖场，选取该场仔猪白痢临床症状明显的病猪63头。病猪均为2～3周龄仔猪，体温表现正常，排白色或灰白色粪便，粪便多为粥样稀便。

1.2 试剂

麦康凯琼脂培养基粉、营养肉汤（NB）、营养琼脂粉等购买于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。肠杆菌科细菌生化常规鉴定管购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 抗菌药物纸片

氨苄西林药物敏感纸片（10 μg/片）、硫酸安普霉素药物敏感纸片（10 μg/片）、磺胺甲基异恶唑药物敏感纸片（300 μg/片）、新霉素药物敏感纸片（30 μg/片）、磺胺异恶唑（300 μg/片）、氟苯尼考药物敏感纸片（30 μg/片）、青霉素药物敏感纸片（10 IU/片）、庆大霉素药物敏感纸片（10 μg/片）、头孢噻呋药物敏感纸片（10 μg/片）购自杭州微生物试剂有限公司。

1.4 试验仪器

无菌洁净工作台、手提式高压灭菌器、隔水式电热恒温培养箱、酒精灯、离心管、无菌棉拭子、接种环、玻璃培养皿等由辽宁省动物疫病预防控制中心提供。

2 方法

2.1 病料采集

用温水和脱脂棉清洗白痢仔猪肛门部位，再用75%的酒精棉球和碘酊进行消毒。彻底清洁、消毒后，将无菌棉拭子插入肛门内，采集直肠粪便病料。并将样品棉拭子放入无菌的10 ml离心管中，密封保存于4℃冰盒中，快速送至实验室。

2.2 病原菌初步分离

按照麦康凯琼脂培养基粉说明书要求，制备麦康凯琼脂培养基，于37℃过夜检菌后使用。将采集的粪便棉拭子涂布于合格的麦康凯琼脂培养基中，倒置37℃培养18～24 h。观察培养基中的典型菌落，挑取红色金属光泽的圆形菌落为初步分离的大肠杆菌分离株。将初步分离的菌落接种于营养肉汤中，于37℃振荡培养器中，180 r/min培养8 h后，于30%灭菌甘油中-80℃保存、备用。

2.3 大肠杆菌生化反应鉴定

按照肠杆菌科细菌生化常规鉴定管说明书要求，对初步分离的仔猪白痢大肠杆菌进行生化反应鉴定。将初步分离的大肠杆菌分离株接种于生化常规鉴定管中，37℃过夜培养，观察分离株对葡萄糖、鸟氨酸、硫化氢、蛋白胨、赖氨酸、苯丙氨酸、卫矛醇、乳糖、尿素、氨基酸对照及枸橼酸钠11项生化反应结果。根据生化反应管变化及编码鉴定表，对大肠杆菌分离株进行生化鉴定。

2.4 大肠杆菌分离株药物敏感性试验

将经生化反应鉴定管确定的大肠杆菌分离株接种于3 ml的营养肉汤中，于37℃、180 r/min振荡过夜培养。在洁净工作台中，用微量移液器取大肠杆菌培养液100 μl，涂布于检菌合格的普通琼脂培养基中，用灭菌的三角玻璃棒将菌液涂抹均匀，正置待菌液完全吸收干燥后，用无菌镊子取药物敏感测试纸片，均匀平贴于平皿中，药物敏感纸片间相隔一定距离，等待1～2 min，待药敏片与培养基贴牢后，倒置37℃过夜培养。用游标卡尺测量抑菌环直径，判断大肠杆菌分离株对受试药物的敏感性。药敏纸片抑菌环直径范围评价标准见表1。

表1 药敏纸片抑菌环直径范围评价标准

3 结果

3.1 大肠杆菌分离、鉴定结果

经麦康凯琼脂鉴别培养基培养，从63份仔猪白痢病料中共初步分离到大肠杆菌分离株61株。初筛株经肠杆菌科细菌生化常规鉴定管鉴定，最终确定大肠杆菌分离株55株。其余6株菌经鉴定为阴沟肠杆菌（E.cloacae）2株、产气肠杆菌（E.serogenes）1株、聚团肠杆菌（E.agglomerans）1株、奇异变形杆菌（P.mirabilis）1株、红色沙雷氏菌（S.rubidaen）1株。具体病原菌分离、鉴定结果见表2。

表2 仔猪白痢病原菌分离、鉴定结果

3.2 大肠杆菌分离株药敏试验结果

根据药敏试验结果，55株仔猪白痢大肠杆菌分离株中，24株对氨苄西林耐药、21株对硫酸安普霉素耐药、42株对磺胺甲基异恶唑耐药、32株对新霉素耐药、38株对磺胺异恶唑耐药、29株对氟苯尼考耐药、40株对青霉素耐药、22株对庆大霉素耐药、16株对头孢噻呋耐药。具体大肠杆菌分离株药敏试验结果见表3。大肠杆菌分离株耐药情况见图1。

表3 仔猪白痢大肠杆菌药物敏感性结果

图1 大肠杆菌分离株对受试药物耐药情况

3.3 大肠杆菌分离株多药耐药情况

55株仔猪白痢大肠杆菌分离株对受试的9种抗菌药物表现出不同程度的多药耐药现象。分离株最少耐受2种药物，最多耐受8种药物。耐受2～8种药物的菌株数分别为3株（5.5%）、8株（14.5%）、12株（21.8%）、15株（27.3%）、10株（18.2%）、5株（9.1%）及2株（3.6%）。其中耐受5种药物的菌株数最多，为15株。分离株多药耐药情况见图2。

图2 大肠杆菌分离株多药耐药情况

4 讨论

腹泻病对生猪养殖业危害巨大，仔猪尤为严重。据报道，70%的仔猪死亡病例中均伴有腹泻现象，且多种仔猪疾病多由腹泻造成机体抵抗能力下降而引起[9]。因此，及时、有效的仔猪腹泻防治措施对保障养殖业发展及食品安全均具有重要意义。

大肠杆菌作为环境常在菌，是仔猪红痢及仔猪白痢的主要病原菌。本试验于沈阳某生猪养殖场63头仔猪白痢病猪中分离、鉴定大肠杆菌55株。药敏试验结果表明，55株仔猪白痢大肠杆菌分离株对受试的9种抗菌药物均产生不同的耐药性。耐药性由高至低分别为磺胺甲基异恶唑、青霉素、磺胺异恶唑、新霉素、氟苯尼考、氨苄西林、庆大霉素、硫酸安普霉素、头孢噻呋，耐药率分别为76.4%、72.7%、69.1%、58.2%、52.7%、43.6%、40.0%、38.2%、29.1%。该结果与文献报道其他地区的耐药性有一定差异，如吴燕燕等报道，上海地区猪源大肠杆菌分离株对青霉素、氨苄西林和头孢噻呋耐药性较高，对氟苯尼考和庆大霉素敏感[10]；黎满香等报道，湖南地区猪源大肠杆菌对青霉素及磺胺甲基异恶唑耐药，对头孢噻呋及氨苄西林敏感[4]；钟雯等报道，吉林地区猪源大肠杆菌分离株对氨苄西林、磺胺类药物中度敏感，对庆大霉素高度耐药[11-12]。不同地区耐药性调查结果差异较大，可能与该地区长期的用药习惯有关。因此应根据药敏试验结果，选取敏感性较高的药物，对受试养殖场仔猪白痢进行治疗。

多药耐药分析结果表明，55株仔猪白痢大肠杆菌分离株均表现出不同程度的多药耐药情况。分离株最少耐受2种药物，最多耐受8种。其中耐受5种药物的分离株最多，占27.3%。多药耐药菌株由于能够同时对多种抗菌药物产生高水平耐受，给临床疾病治疗造成严重挑战。受试养殖场，大部分仔猪白痢大肠杆菌分离株已经同时耐受5种抗菌药物，多药耐药情况较为严重。其中2株分离株为同时耐受8种抗菌药物，虽然菌株占比较小（3.6%），但由于其多药耐药水平较高，由其引起的疾病治疗难度也相对较大。建议该养殖场根据药物敏感性试验结果，适当调整治疗方案，在保证治疗效果的同时避免高耐药菌株的出现。