等温扩增荧光法（IAFT）快速检测食品中沙门菌方法的建立

□ 王 耕 张 薇 陈安东 王振超 北京晟泰勃科技有限公司

等温扩增荧光法（IAFT）快速检测食品中沙门菌方法的建立

□ 王 耕 张 薇 陈安东 王振超 北京晟泰勃科技有限公司

沙门菌属一类革兰氏阴性杆菌，是引起人类食物中毒的常见细菌之一。传统的沙门菌检测方法主要是经过增菌培养，分离琼脂平板培养等步骤后，通过形态学和染色法和各种生化指标，如硫化氢气体、赖氨酸脱羧酶、氧化酶、靛基质尿素和KCN等加以鉴定。

等温扩增荧光技术（Isothermal Amplification Fluorescent Method，IAFT）是核酸体外扩增和荧光法技术的结合，在恒温条件下进行，通过添加特殊的DNA聚合酶和特异性引物，在扩增的同时加入荧光基团，通过荧光信号累积实时监控扩增过程，实现核酸快速扩增和检测，并对产物做溶解曲线分析。作为一种全新的快速鉴定方法，该方法所需实验条件简单、前处理要求低、特异性强、扩增速度快，可广泛用于食源性微生物快速鉴定领域。

本研究应用新型核酸等温扩增技术建立食品中沙门菌的快速检测方法，针对其特异性核酸保守序列fimY基因进行扩增和检测，总计使用了16株多种细菌的菌株，其中8株为沙门菌，结果表明，除8株沙门菌有阳性扩增曲线外，其余菌株均无扩增，该方法具有高度特异性。

实验仪器及材料

材料

沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌菌液；引物（6条）；IMM，optigene Limited公司；细菌基因组核酸提取试剂盒（STP）。

仪器

genie Ⅱ。

实验步骤

引物稀释

将引物稀释成以下浓度，FIP/BIP：40 pmol/μL；F3/B3：5 pmol/μL；LF/LP：20 pmol/μL。

反应体系

IMM 15 μL；引物6 μL；样本4 μL。

反应程序设定

65 ℃反应40 min。溶解曲线98～80 ℃，0.05℃收集一次荧光信号。

样本制备

1 核酸提取试剂盒

按照试剂盒说明进行操作。

2 加热煮沸法

取菌液1 mL离心10 min，弃上清后加入去离子水，100 ℃加热10 min，置于冰上备用。

实验结果

实验结果显示，在16株不同的菌株中，只有8株沙门菌对应的样品中出现了S型扩增曲线，其他菌株和阴性对照均未出现扩增，结果特异，如图1所示。

用加热煮沸法提取核酸后扩增结果，曲线平滑度和扩增时间均比使用试剂盒提取的稍差，但特异性一致，如图2所示。

图1 扩增曲线

图2 煮沸法扩增曲线

讨论

本研究使用等温扩增荧光法（IAFT）为基础建立了沙门菌的检测体系，与传统方法比较，其结果符合率达到100%。从上述实验结果中可看出，样本仅需一步增菌即可上机进行检测，除可使用试剂盒提取纯度较高的核酸样本进行扩增和检测外，煮沸法抽提同样适用，且准确率与传统方法一致，实现了未知样本的核酸现场快速检测。

结论

集成核酸等温扩增核心技术，以等温扩增荧光快速检测技术为基础建立了沙门菌IAFT快速检测技术体系。同时使用两种核酸提取方法进行验证，证明其不但可在实验室进行实验，野外现场同样适用，不依赖实验室仪器。

经与传统方法以及PCR法进行比价和评价，其准确率与传统培养法完全一致，且更为特异、敏感、精确、快速和便捷，适合于任何条件下的现场快速检测，对于突发食物中毒等事件可起到第一时间准确诊断的作用，不仅适用沙门菌，其他常见的致病食源性微生物同样可用，可为食品安全的质控和监管提供必要的技术支撑，应用前景广阔。