丹红注射液对小鼠感染人巨细胞病毒肝炎的干预研究

秦雪琴，陈悦，吴文琴，雷尚芳，陈德森

(1.十堰市太和医院,湖北医药学院附属医院,a.感染科,b.急诊科,湖北 十堰 442000;2.湖北医药学院,湖北 十堰 442000)



丹红注射液对小鼠感染人巨细胞病毒肝炎的干预研究

秦雪琴1a，陈悦1a，吴文琴1b，雷尚芳1a，陈德森2

(1.十堰市太和医院,湖北医药学院附属医院,a.感染科,b.急诊科,湖北 十堰 442000;2.湖北医药学院,湖北 十堰 442000)

目的 研究丹红注射液对小鼠感染人巨细胞病毒(HCMV)病毒性肝炎的干预机制，为临床治疗HCMV提供理论依据。方法 BALB/c 品系小鼠80只，随机数字表编号法分对照组、模型组、丹红注射液A、B、C组(腹腔注射丹红注射液，剂量分别为0.5、1、2 mg·10 g-1·d-1)，对照组、模型组用生理盐水干预治疗，连续28 d。28 d后尾静脉采血，放免法检测小鼠血清肝纤维化血清学指标[Ⅳ型胶原(cⅣ)、层黏连蛋白(LN)、转化生长因子-βl(TGF-βl)、透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)]，用小鼠尾静脉血血清检测肝功能五项[天冬氨酸氨基转移酶(AST)、胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBil)、谷氨酰转移酶(GGT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)]；检测肝脏组织中肝微粒体细胞色素P450亚型酶[CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9]活性。结果 与模型组比较，丹红注射液B、C组治疗28 d后，P450亚型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性、血清肝纤维化血清学指标cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ及肝功能AST、ALT均有不同程度降低(P<0.05)，均差异有统计学意义。丹红注射液A组各指标间比较，差异无统计学意义，B、C组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 丹红注射液可抑制小鼠P450亚型酶活性，降低药物代谢时对肝脏的毒性，并通过降低TGF-βl而促进肝功能恢复，对小鼠感染，HCMV病性肝炎有明确的治疗作用。

丹红注射液；人巨细胞病毒肝炎；细胞色素P450亚型酶酶；转化生长因子-βl；肝功能

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是双链线状DNA病毒，属疱疹病毒科，其主要生物学特征为同期性潜伏-活动[1]。HCMV病毒普遍存在于自然界，当抵抗力下降时病毒侵入机体感染肝脏、血液及神经系统； 如感染肝脏会造成严重的肝功能损伤，如肝脾肿大、高胆红素血症、病理性黄疸，随着病毒大量复制繁殖，肝脏组织严重受损，最终将发展为肝纤维化，并因肝衰竭而造成致死性损伤[2]。本实验研究首先建立小鼠HCMV肝炎动物模型，观察丹红注射液对其细胞色素P450亚型酶、转化生长因子-βl(TGF-βl)及肝功能等的影响，探讨丹红注射液保肝护HCMV肝炎的作用机制，以期其应用于临床预防和治疗HCMV病毒性肝炎提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 BALB/c 品系小鼠80只，雌雄各半，体质量22～25 g，周龄10～11周，由中国医学科学院实验动物中心提供实验动物，合格证编号为SCXK(京)2005-0013。小鼠采用自由配对原则，随机数字表编号随机分为对照组，模型组，丹红注射液按经腹腔注射剂量的不同分A、B、C组，每组16只(雌雄比为1∶1，每组8对16只)。

1.2 仪器及试剂 Waters2010型高效液相色谱仪；HCMV-AD169病毒(6．0 logTCID50/mL病毒株)作为实验用毒种[3]；丹红注射液(菏泽步长制药有限公司提供，批号：Z20026866)。

1.3 造模及干预方法 参照文献资料[4]，模型组及丹红注射液A、B、C组分别经腹腔内接种HCMV-AD169病毒株的病毒悬液[1．0 mL/(6．0logTCID50/mL)]，对照组小鼠腹腔注射生理盐水(每只1.0 mL)。对照组新生小鼠肝组接种后配对分开饲养，记录受精时间，待所有新生小鼠出生后第10 天开始干预治疗，干预前5组动物中随机挑选每对小鼠生产的新生小鼠1只(每组各8只新生小鼠)。对照组及模型组腹腔注射0.5 mL生理盐水，丹红注射液A、B、C组经腹腔注射丹红注射液(0.5、1、2 mg·10 g-1·d-1)进行干预，全部动物均干预治疗28 d。实验期间动物福利：饲养环境要求动物房恒温(22 ℃，湿度50%～75%)，配对分开饲养单笼饲养，12 h交替光照；饲养要求满足实验动物伦理[5]，小鼠自由饮水，普通饲料喂养，观察动物饮水进食情况，小鼠生产新生小鼠后及时清理粪便。本模型建立选用目前成熟可靠的技术，利用HCMV可经胎盘垂直传播至子代新生小鼠的生物学特性，且经聚合酶链反应(PCR)法对子代小鼠尾静脉血分离培养均得出HCMV-DNA的阳性结果，造模成功率为100%。

1.4 检测指标及方法 参照文献[6]，小鼠断尾后用取样器吸取静脉血0.1 mL，置于已编号的肝素管中，放免法检测小鼠血清肝纤维化血清学指标[Ⅳ型胶原(cⅣ)、层黏连蛋白(LN)、TGF-βl、透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)]，常规检测小鼠肝功能五项[天冬氨酸氨基转移酶(AST)、胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBil)、谷氨酰转移酶(GGT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)] 。小鼠取血后，断头处死，取肝组织置于已编号的容器内放入-4 ℃冰箱暂存，采用高效液相色谱法(HPLC)检测P450亚型酶。检测前先将肝组织捣碎研磨，4 ℃下按1∶4比例加入匀浆缓冲液(11．5 g·L-1氯化钾，50 mmol·L-1Tris，pH 7.4)匀浆，用GR22GⅡ型高速冷冻离心机差速离心法匀浆，5 000 r·min-1离心30 min后离心管中沉淀的组织重悬于0.25 mol·L-1蔗糖溶液中即为小鼠肝微粒体提取液标本，分别编号置于-80 ℃冰箱暂存备用。检测时取出标本置于SHA-C水浴恒温振荡器解冻并振荡30 min，37 ℃先孵育30 min，再5 000 r·min-1离心20 min 后用取样器取上清液 250 μL备用，采用Waters 2010型高效液相色谱仪进样检测。P450酶含量测定： 用 pH 7.4 的磷酸缓冲液将提取的小鼠肝微粒体提取液(250 μL上清液)加入 4 mg 连二亚硫酸钠，反应 4 min，将其平分到比色皿中，在紫外分光光度计上扫描基线， 然后向样品杯中通入 CO 30 s，稳定 5 min，在波长 400～500 nm 范围内扫描得到P450-CO 复合物吸收光谱。 计算公式：P450含量(μmol·L-1)=[△OD(450～490 nm)×1 000]/[91×微粒体蛋白浓度(g·L-1)]。

2 结果

2.1 丹红注射液对小鼠P450亚型酶的影响 如表1。对照组P450亚型酶酶中CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9活性均保持正常水平。模型组P450亚型酶表达均明显增强，与对照组比较,P<0.05，差异有统计学意义。丹红注射液B、C组经28 d治疗，CYP2E1、 CYPIA2、CYP3A4明显降低，与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。B、C组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)，丹红注射液A组有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 丹红注射液对小鼠血清肝纤维化血清学指标的影响 见表2。模型组小鼠血清肝纤维化血清学指标(cⅣ、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ)显著升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明母代小鼠均感染HCMV病毒， HCMV已垂直传播给子代小鼠，HCMV病毒增殖造成肝纤维化病理改变。丹红注射液B、C组经28 d治疗，cIV、TGF-βl及PC-Ⅲ明显降低，与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。B、C组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)，但丹红注射液A组降低不明显(P>0.05)。2.3 丹红注射液对小鼠肝功能的影响 模型组小鼠肝功能五项(AST、TBA、TBiL、GGT、ALT)均显著升高，与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)，说明子代小鼠均感染HCMV病毒后造成严重的肝功能损害。丹红注射液B、C组经28 d治疗，AST及ALT明显降低，与模型组比较,P<0.05，B、C组组间比较(P>0.05)。TBA、GGT 、TBil有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，丹红注射液A组仅AST差异有统计学意义。如表3。

3 讨论

机体感染HCMV后在肝脏组织复制繁殖，破坏肝细胞，造成大量肝细胞变性、坏死，肝星状细胞被激活、增殖和转化等病理改变并最终导致肝脏组织纤维化而丧失解毒功能，肝功能及血清肝纤维化血清学等指标异常升高。P450同工酶是主要存在于肝细胞内质网，是机体混合功能氧化酶系的主要成分，有数十种亚型，目前证实与药物代谢关系密切的有CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9等[7]。药物90%均经P450亚型酶代谢，故影响P450亚型酶活性的药物均会影响药物的疗效， P450亚型酶活性增强常会导致过敏等不良反应，并造成药物的治疗作用降低，而P450亚型酶活性降低会使经此酶代谢药物代谢减慢，血药浓度升高而增强疗效[8]。近年来大量中草药提取液如丹红注射液等被尝试应用到临床治疗HCMV并取得一定疗效，丹红注射液是将中药丹参、红花按科学配方提取的复方注射液。《药品化义》记载红花味辛性温、善通利经脉，《吴普本草》记载丹参味辛性凉、可治心肌腹痛[9]。丹参主要有效成分包括丹参酚酸、丹参酮、红花黄色素等，其性苦，微寒，归心、心包、肝经，既能活血又可清热；红花主要成分有红花素、红花醌及红花苷等，辛温，归心、肝经，具活血化瘀之效，同时辛温之性有助于化痰湿，两药合用共奏活血清热化痰之功[10]，两药一温一凉，具有调经镇痛、凉血消痈、活血通经、散癖镇痛之功效，能有效降低血液黏稠度、改善微循环，正合中医治疗肝病的原则[11]。

观察发现，小鼠感染HCMV后出生的新生代小鼠均垂直传染HCMV病毒，因为除对照外，其它4组小鼠cIV、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ及肝功能五项(AST、TBA、TBil、GGT、ALT)均异常增高。在用丹红注射液干预治疗28 d后，模型组P450亚型酶活性、cIV、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ及肝功能五项(AST、TBA、TBil、GGT、ALT)均无明显改善，而丹红注射液B、C组P450亚型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性、血清肝纤维化血清学指标中cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ及肝功能AST、ALT均明显降。多项研究表明，P450亚型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4与药物代谢及相互作用密切相关，其降低有利于药物的代谢并减少不良反应、增加疗效[12]。丹红注射液B、C组P450亚型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性降低的机制因缺乏相关的实验报告，但在本临床观察印证丹红注射液确具有降低CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性的作用。丹红注射液B、C组的cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ等指标的下降应与丹红注射液具有活血化瘀，增加肝血流量进而改善肝脏组织微循环有关。HCMV病毒在肝脏增殖时会对正常肝细胞造成严重破坏，肝细胞坏死时Na+，K+-ATP酶活性会降低，肝细胞能量的代谢障碍，并导致肝细胞修复能力下降。结合机体电生理特点来看，丹红注射液可能具有增强了Na+，K+-ATP酶活性,促使cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ降低，抑制HCMV病毒对肝细胞的破坏，改善肝细胞内有毒物质代谢而起到细胞保护作用[13]。另外，HCMV会造成小鼠肝脏蛋氨酸腺苷蛋氨酸环化酶和Na+，K+-ATP酶活性降低，模型组及丹红注射液A、B、C组小鼠肝细胞大量破坏、肿胀、变性坏死，造成小鼠肝功能异常升高。在使用丹红注射液干预治疗28 d后，丹红注射液B、C组肝功能中AST、ALT明显降低，说明其对已感染HCMV的肝脏具有保护作用。大量实验及临床研究证实丹红注射液具有活血化瘀，凉血消痈的药理特性[14]。在本实验中，我们观察到丹红注射液可抑制小鼠P450亚型酶活性，这对降低药物代谢时对肝脏的毒性，增强药物疗效，促进肝功能恢复起到了至关重要的作用。丹红注射液还通过降低TGF-βl而促进肝功能恢复，并有可能具有增强Na+，K+-ATP酶泵功能，促进质膜磷脂甲基化，改善肝脏组织微循环，增加肝脏组织供氧，抑制HCMV增殖引起的炎性反应造成的肝损伤而达到保护肝脏的目的，对小鼠感染HCMV病毒病性肝炎有明确的干预治疗作用。

表1 小鼠P450 亚型酶活性比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表2 小鼠肝纤维化血清学指标比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表3 小鼠肝功能五项比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型比较，bP<0.05。

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Intervention of danhong injection on mice infected with hepatitis HCMV

QIN Xueqina,CHEN Yuea,WU Wenqinb,et al

(a.DepartmentofInfectiousDiseases，b.EmergencyDepartment,TaiheAffiliatedHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To explore the intervention mechanism of Danhong Injection on mice infected with human cytomegalovirus(human cytomegalovirus，HCMV)viral hepatitis,to provide theoretical basis for clinical treatment of HCMV.Methods Eighty BALB/c strain mice were randomized into control group,model group,Danhong Injection A,B,C group,by intraperitoneal injection of Danhong Injection(0.5,1,2 mg·10 g-1·d-1).The control group and model group received normal saline intervention therapy for 28 days.28 days later,blood samples were collected from tail vein for immunoassay detection of serum markers of liver fibrosis in mice [Ⅳ collagen(cⅣ),laminin(LN),transforming growth factor beta 1(TGF-β1),hyaluronic acid(HA),type Ⅲ procollagen(PC-Ⅲ)],detection of liver functions in mice [aspartate aminotransferase(AST),bile acid(TBA),total bilirubin(TBil),gamma glutamyl transferase(GGT)alanine aminotransferase(ALT)],and the activities of liver microsomal cytochrome P450isoforms [CYP2E1,CYPIA2,CYP3A4,CYP2D6 AND CYP2C9].Results Compared with the model group,28 days after the treatment,activities of CYP2E1,CYPIA2 and CYP3A4,cIV,TGF-βl,PC-III,AST and ALT were all decreased in Danhong Injection B and C group with significant differences(P<0.05).There was no statistically significant difference among Danhong Injection A,B and C group(P>0.05).Conclusions Danhong Injection can inhibit the activity of P450isoforms in mice,decrease toxicity to liver during drug metabolism and promote the recovery of liver function by reducing TGF-βl,which achieves obvious efficacy on mice-infected human cytomegalovirus hepatitis.

Danhong injection;Human cytomegalovirus hepatitis;Cytochrome P450enzyme;Transforming growth factor beta 1;Liver function

湖北省卫生与计划生育委员会重点项目(WJ2015MB224)

陈德森，男，副教授，研究方向：HCMV肝炎治疗与肝移植，E-mail：fenyanqin163163@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.008

2016-05-11，

2016-08-07)