金沙牛化石片高效液相色谱指纹图谱研究

刘仔，蓬展鹏，邝惠珍，董明国

(东莞市中医院药学部，广东 东莞 523000)



金沙牛化石片高效液相色谱指纹图谱研究

刘仔，蓬展鹏，邝惠珍，董明国

(东莞市中医院药学部，广东 东莞 523000)

目的 建立金沙牛化石片高效液相色谱(HPLC)法指纹图谱，为科学评价金沙牛化石片质量及其生产工艺稳定性提供依据。方法 采用AgiLent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，以0.2%磷酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为254 nm，柱温为25 ℃。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对10批金沙牛化石片进行相似度评价。结果 以夏佛塔苷为参照峰，初步建立了金沙牛化石片HPLC指纹图谱，确定了18个共有峰，10批金沙牛化石片样品指纹图谱相似度均在0.9以上。结论 该方法简便、准确、重复性好，可用于金沙牛化石片质量控制。

金沙牛化石片；高效液相色谱；指纹图谱

金沙牛化石片，批准文号：粤药制字Z20070471，是由金沙牛、广金钱草、穿山甲、鸡内金、滑石、川牛膝、海金沙、冬葵果、皂角刺、桃仁、三七、石韦多种中药材提取加工制成，根据我院老中医多年临床经验所得，应用于治疗泌尿结石、尿路感染等症状疗效显著[1-2]。课题组前期研究表明[3]，该药具有增加尿量、增加尿液中枸橼酸、减少尿酸及减轻尿路感染炎性反应而发挥防治泌尿系结石的作用。

目前，关于金沙牛化石片质量控制方面的研究尚未见报道，难以客观反映该药的整体质量状况以及各生产批次的优劣情况。而中药指纹图谱技术具有系统性、整体性和稳定性等特点，可较好地反映含有复杂成分的中药制剂其内在质量的均一性和稳定性，是解决金沙牛化石片生产质量问题的有效手段[4-8]。因此，本文建立了金沙牛化石片指纹图谱的分析方法，对不同生产批次的金沙牛化石片进行研究并得出其对照指纹图谱，以期为该片剂的质量控制以及生产加工提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AgiLent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，DAD检测器，二元梯度泵)，软件为chemstation色谱工作站；AgiLent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；SHIMADZU AUW120D电子天平(日本岛津公司)；数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)。

1.2 试药 夏佛塔苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111912-201302，含量92.5%)；金沙牛化石片(每素片重0.25 g，东莞市中医院医院制剂)。

甲醇、乙腈为色谱纯(美国默克公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流速1.0 mL·min-1；以乙腈为流动相 A，0.2%(体积分数)磷酸的水溶液为流动相B，按表1程序进行梯度洗脱。检测波长254 nm；柱温25℃；进样体积20 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.2 对照品溶液的制备 取夏佛塔苷对照品约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加80%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为91.58 mg·L-1的对照品储备液。精密移取对照品储备液5 mL至10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得45.79 mg·L-1的对照品溶液。

2.3 金沙牛化石片供试品溶液制备 取金沙牛化石片50片，去除糖衣后，混匀，研细，取约10 g，精密称定，置100 mL 圆底烧瓶中,加入 80%甲醇50 mL，称定重量，水浴回流提取1 h，放冷，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批金沙牛化石片(批号:20140804)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定。以夏佛塔苷峰为参照，其保留时间和峰面积为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD值均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批金沙牛化石片(批号:20140804)，分别于制备后0、2、4、8、16、24 h进样，按“2.1”项下色谱条件测定。以夏佛塔苷峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD值均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取同一批金沙牛化石片(批号:20140804)，分别精密称取6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。以夏佛塔苷峰为参照，其保留时间和峰面积为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD值均小于3%，表明本方法重复性良好。

2.5 金沙牛化石片HPLC指纹图谱的建立与分析

2.5.1 指纹图谱的建立及共有峰的标定 按“2.1”项下色谱条件进行测定，得到S1～S10供试品的HPLC指纹图谱，根据色谱图中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取18个共有峰作为特征指纹峰。以峰面积较大且稳定，分离度好，出峰时间适中的13号峰作为参照峰，经与夏佛塔苷对照品的出峰时间及紫外图谱比对，确认13号峰为夏佛塔苷(广金钱草中有效成分)，见图1。以13号夏佛塔苷色谱峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积值。

图1 金沙牛化石片HPLC图

2.5.2 指纹图谱的相似度评价 采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对10批金沙牛化石片HPLC图谱进行处理，匹配结果见图2，所生成的对照图谱见图3。10批金沙牛化石片与对照指纹图谱的相似度分别为：0.921，0.983，0.955，0.983，0.931，0.950，0.981，0.977，0.970，0.968。

图2 10批金沙牛化石片

图3 对照指纹图谱匹配色谱图

各批金沙牛化石片与对照指纹图谱的相似度均较高，为了保证金沙牛化石片的质量，建议规定按中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.9。

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备 金沙牛化石片的制剂工艺中，除金沙牛、穿山甲、三七为细粉入药，其余九味药材均为水提取物入药。考虑到水提取物极性较大，本试验选用了水、80%甲醇、甲醇作为溶媒比较提取效果，同时考察了超声和水浴回流提取方式及提取时间的影响，结果以80%甲醇水浴回流提取1 h时指纹峰信息较为丰富且干扰较少。

3.2 检测波长的选择 比较254、272、300、330 nm波长时的色谱峰数目、响应强度、各峰之间的分离度，最终选用254 nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择 比较了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸4种洗脱体系，结果用乙腈-0.2%磷酸体系洗脱时，大多数峰的对称性较好、理论塔板数较高，各峰之间的分离度较好，并且基线最为平稳，因此最终选择乙腈-0.2%磷酸作为流动相。

3.4 色谱柱筛选 尝试了KromosiL C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Thermo HypersiL ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)及AgiLent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，分离情况无明显差异，但使用ZORBAX SB-C18柱时峰形较好，且该色谱柱耐酸性较强，最终选用ZORBAX SB-C18色谱柱。

3.5 指纹图谱分析 本实验采用HPLC建立了金沙牛化石片指纹图谱分析方法，以13号夏佛塔苷峰为参照峰确认了金沙牛化石片18个共有峰，通过相似度评价软件生成了10批金沙牛化石片的对照指纹图谱，并计算出各批样品与对照指纹图谱之间的相似度。相比于单个主成分含量测定而言，指纹图谱能从整体层面综合反映中药复方制剂的质量，该方法可为金沙牛化石片的质量评价及控制提供依据，有助于课题组后续开展谱效关系研究。

[1] 何仰高，董国明，张凤敏，等.金沙牛化石片治疗尿路结石72例临床观察[J].实用中医内科杂志，2014,28(1):74．

[2] 何仰高，董国明，刘仔，等.金沙牛化石片治疗尿路结石36例[J].中国中医药科技，2013,20(6):674．

[3] 莫琰，张继峰，卢广明，等.金沙牛化石片对泌尿系结石尿液中成石因素影响的临床研究[J].河北中医，2011,33(12):1774．

[4] 李瑛，吴小明，汪永忠，等.UPLC法同时测定痺苓祛痛颗粒中常春藤皂苷元和齐墩果酸含量[J].安徽医学，2015,36(3):259-261．

[5] 牛海军，李晓亮，李光辉，等．葛酮通络胶囊 HPLC 指纹图谱研究[J]．安徽医药，2016,20(2):249-253．

[6] 邱宏聪，马军花，陈露，等．复方金钱草颗粒的指纹图谱[J]．中国实验方剂学杂志，2016,22(1):36-39．

[7] 徐益清，杨辉，罗华友．高效液相色谱指纹图谱在中药制药过程中的研究进展[J]．海峡药学，2016,18(2)：8-11．

[8] 李强，杜思邈，张忠亮，等．中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J]．中草药，2013,44(22):3095-3104．

HPLC fingerprint of jinshaniu huashi tablets

LIU Zai，PENG Zhanpeng，KUANG Huizhen，et al

(PharmaceuticalDepartment,DongguanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Dongguan,Guangdong523000,China)

Objective To establish HPLC fingerprints of jinshaniu huashi tablets,to provide basis for the scientific assessments of jinshaniu huashi tablets’ quality and stability of the production process.Methods The separation was performed on a ZORBAX SB-C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)with 0.2% phosphoric acid-acetonitrile as the mobile phase in a gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 254 nm,and the column temperature was set at 25 ℃.Fingerprint Similarity Evaluation Software(edition 2012)of Chinese Pharmacopoeia Commission was used to evaluate the similarity of the 10 batches of Jinshaniu Huashi Tablets.Results The common mode for the HPLC fingerprint was set up with schaftoside as the reference peak.Eighteen co-processing peaks were selected as the fingerprint peaks of jinshaniu huashi tablets.Good similarities with correlation coefficients higher than 0.9 were found between 10 batches of jinshaniu huashi tablets and the standard fingerpint.Conclusions The method is simple,accurate,and reproducible,which could be used for quality control of jinshaniu huashi tablets.

Jinshaniu huashi tablets;HPLC;Fingerprint

广东省东莞市科技计划项目(2003)

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.010

2016-06-24，

2016-08-11)