黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞TLR4通路的影响

李会哲，周晓红，张 颖，靳晓飞，高维娟

(1.承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000；2.河北中医学院，河北省心脑血管病中医药防治重点实验室，河北 石家庄 050200)

◇研究简报◇

黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞TLR4通路的影响

李会哲1，周晓红2，张 颖2，靳晓飞1，高维娟2

(1.承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000；2.河北中医学院，河北省心脑血管病中医药防治重点实验室，河北 石家庄 050200)

缺氧缺糖/复氧复糖；黄芪甲苷；PC12细胞；TLR4蛋白；MyD88蛋白；细胞凋亡

TLR4受体已经被证明在脑缺血中发挥着关键的作用[1]。 黄芪甲苷可明显减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤中的脑梗死面积，抑制神经细胞凋亡[2]。黄芪甲苷是否通过TLR4/MyD88通路来抑制细胞凋亡？本文以PC12细胞为实验对象，研究黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞TLR4通路的影响，探讨黄芪甲苷抑制细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物和细胞 黄芪甲苷购自上海士峰生物科技有限公司，纯度≥98%(生产批号：15010913) ，PC12细胞由河北医科大学第一医院科研中心许顺江教授惠赠。

1.1.2 试剂和仪器 抑制剂Cli095购自Invivogen公司，TLR4多克隆一抗购自Biovision公司，MyD88单克隆一抗购自CST公司，二抗IgG购自博士德生物有限公司，Caspase-3多克隆一抗和NF-κB 多克隆一抗均购自巴傲得生物科技有限公司，普通培养箱3111型和三气培养箱3131型购自赛默尔菲公司。

2 方法

2.1 PC12细胞的造模及实验分组 参照Kikuchi等[3]的方法建立缺氧缺糖/复氧复糖细胞模型： 移除原培养基换用无糖Earle′s液，随即把培养瓶放入 三气培养箱中培养4 h后，换正常培养基放入普通培养箱培养24 h。取对数期PC12细胞，随机分为7组：正常对照组、正常+黄芪甲苷组、缺氧缺糖/复氧复糖组(模型组)、DMSO组、黄芪甲苷组(AST，100 μmol·L-1)、Cli095组(3 μmol·L-1)、黄芪甲苷+Cli095组。第1组正常培养，不进行任何处理。 后4组均于造模前0.5 h给药，直至培养结束。第2组在正常培养液加入100μmol·L-1的黄芪甲苷，给药方式同后4组。免疫组化检测caspase-3和NF-κB ，Western blot方法检测MyD88和TLR4蛋白表达。

3 结果

caspase-3 结果：与正常组相比，正常+黄芪甲苷组没有统计学差异，而模型组阳性细胞数明显增加(P<0.05)；与模型组相比，DMSO组阳性细胞数没有明显差异(P>0.05)，但黄芪甲苷组、抑制剂组、黄芪甲苷+Cli095组阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+抑制剂组阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05)，而Cli095组增加(P<0.05)，见Tab 1。NF-κB 各组变化趋势与caspase-3 相同，见Tab 2 。 MyD88和TLR4的结果趋势同caspase-3结果相同，见Tab 3，4。

GroupDose/μmol·L-1CellquantityNormal-1.00±0.002Normal+AST1001.25±0.50Model-86.50±1.29#DMSO0.00182.00±3.16#AST10026.00±5.10*Cli095350.75±4.65△AST+Cli095100+325.00±6.16*

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsAST

GroupDose/μmol·L-1CellquantityNormal-1.03±0.03Normal+AST1001.25±0.002Model-85.55±1.33#DMSO0.00183.08±2.13#AST10025.98±4.32*Cli095352.15±4.36△AST+Cli095100+324.85±5.16*

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsAST

GroupDose/μmol·L-1GrayvalueNormal-124.33±30.57Normal+AST100118.00±29.61Model-384.33±26.31#DMSO0.001375.00±22.00#AST100177.00±54.14*Cli0953291.33±14.98△AST+Cli095100+3184.67±55.52*

#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsmodel；△P<0.05vsAST

GroupDose/μmol·L-1GrayvalueNormal-77.67±39.31Normal+AST10071.00±36.06Model-434.33±69.60#DMSO0.001427.67±70.40#AST100102.67±5.03*Cli0953305.33±86.58△AST+Cli095100+3136.67±32.65*

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsAST

4 讨论

当机体脑缺血/再灌注损伤时，TLR4受体被激活，与细胞内MyD88相结合的同时使信号由细胞外传递到细胞内[4]，并且激活一系列下游反应，最终导致I-κb磷酸化而降解与MAPK家族的激活[5]。前者使NF-κB移位到细胞核内，NF-κB 能使TNF-α等炎性细胞因子转录并在细胞中高度表达，大量的炎症瀑布最终导致细胞凋亡[6]。后者激活的MAPK家族使JNK等在细胞中高度表达[7]，部分激活的JNK在胞质中促进细胞色素释放，激活caspase-3等引起细胞凋亡[8]，综上所述，TLR4/MyD88通路机制可以导致细胞发生凋亡。

(致谢：本实验在河北中医学院科研中心，在高维娟老师的指导下，周晓红、张颖老师、靳晓飞师弟的帮助下完成。)

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Effect of astragaloside on TLR4 pathway in cultured PC12 cells with oxygen glucose-deprivation and reperfusion

LI Hui-zhe1,ZHOU Xiao-hong2,ZHANG Ying2,JIN Xiao-fei1,GAO Wei-juan2

(1.DeptofPhysiopathology,ChengdeMedicalCollege,Chengde,Hebei067000,China; 2.HebeiUniversityofChineseMedicine,HebeiKeyLaboratoryofChineseMedicineResearchonCardio-cerebrovascularDiseases,Shijiazhuang050200,China)

时间：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.052.html

2016-06-14,

2016-08-30

河北省应用基础研究计划重点项目(No 16967756D); 河北省科技支撑计划项目(No 13272504D); 河北省普通高校高层次人才科学研究计划项目(No GCC2014031)

李会哲(1987-)，女，硕士,研究方向：缺血性脑血管病的发病机制及中医药防治,E-mail:524987216@qq.com; 高维娟(1966-)，女，博士，教授，博士生导师,研究方向：缺血性脑血管病的发病机制及中医药防治,通讯作者,E-mail:gwj6088@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.026

A

1001-1978(2016)12-1772-02

R284.1；R329.25；R392.11；R743.310.22；R977.6