中国汉族大疱性皮肤病GLCCI1变异体与糖皮质激素不敏感无相关性

杜甜甜 付希安 孙勇虎 于功奇 王真真 杨宝琦 卢宪梅 刘 红 张福仁

·短篇论著·

中国汉族大疱性皮肤病GLCCI1变异体与糖皮质激素不敏感无相关性

杜甜甜1，2付希安1孙勇虎1于功奇1王真真1杨宝琦1卢宪梅1刘 红1张福仁1

目的： 应用基因分型技术分析中国汉族种群大疱性皮肤病GLCCI1变异体与糖皮质激素不敏感的相关性。方法： 将187例大疱性皮肤病患者根据控制病情所需糖皮质激素用量分为实验组(糖皮质激素量≤60 mg，n=129)与对照组(糖皮质激素量≥150 mg，n=58)，应用Taqman genotyping技术对研究对象进行位于GLCCI1基因的SNP rs37973基因分型，数据资料应用PLINK软件进行logistic回归分析。结果： 未发现GLCCI1基因的SNP rs37973与中国汉族种群大疱性皮肤病中糖皮质激素不敏感存在显著相关性(P=0.7881,OR=1.062)。结论： GLCCI1变异体与中国汉族种群大疱性皮肤病糖皮质激素不敏感无显著相关。

GLCCI1； 糖皮质激素； 大疱性皮肤病

自身免疫性大疱性皮肤病是一组以皮肤黏膜发生红斑、 水疱、 大疱、糜烂为临床特征的慢性复发性疾病，代表性的疾病有天疱疮、大疱性类天疱疮[1,2]。目前，糖皮质激素(GC，简称：激素)仍为治疗大疱性皮肤病的一线用药。多数患者经过激素治疗能得到有效的长期缓解甚至治愈，但有一少部分患者通过增加激素用量或延长激素的使用疗程仍未获得满意疗效，导致大疱性皮肤病的病死率、费用增高，因此阐明激素不敏感的机制显得尤为重要。2011年Tantisira等[3]通过全基因组关联分析在哮喘患者中揭示了一种新的影响吸入性激素疗效的遗传药理学决定子，发现功能性GLCCI1变异体(rs 37973)与哮喘病人对吸入性激素的反应大大降低相关。后有学者不断在强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、急性移植物抗宿主病等中发现GLCCI1变异体与激素不敏感显著相关[4,5]。本实验目的在于研究中国汉族种群自身免疫性大疱性皮肤病中激素不敏感与GLCCI1变异体是否存在相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 187例大疱性皮肤病患者(包括111例天疱疮，76例大疱性类天疱疮)均为我院门诊及住院患者，均经山东省皮肤病性病防治研究所临床+组织病理+免疫病理确诊。其中敏感组患者129例(病情控制所需激素相当于泼尼松剂量≤60 mg)，男66例，女63例;非敏感组患者58例(病情控制所需激素剂量≥150 mg)，男33例，女25例。所有患者之间无任何血缘关系。患者按照以下方面进行疾病确诊。

天疱疮：(1)典型临床表现：外观正常皮肤或黏膜散发或簇集分布的大疱、水疱，疱壁多薄而松弛，Nikolsky(尼氏征)阳性；(2)组织病理示：棘层松解、表皮内裂隙和水疱；(3)直接免疫荧光：表皮细胞间可见IgG、C3的沉积，呈网状分布；(4)间接免疫荧光：血清中查到IgG抗体。

大疱性类天疱疮：(1)典型的临床特征：好发于胸腹部和四肢近端，在外观正常的皮肤或红斑基础上出现紧张性水疱或大疱，呈半球状，疱壁较厚，不易破溃，破溃后糜烂面常覆以痂皮或血痂，Nikolsky(尼氏征)阴性；(2)组织病理示：表皮下水疱，真皮乳头血管周围有嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润；(3)直接免疫荧光：基底膜带可见IgG、C3线状沉积；(4)间接免疫荧光：血清中查到IgG抗体。

1.2 材料 经患者知情同意后，采集其上肢静脉血液(至少5 mL)，将血样用抗凝管盛装，放入超低温冰箱(-80℃)中存放。采用AXYGEN试剂盒提取基因组DNA，取适量DNA进行纯度检测并标化。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针设计 本实验所用GLCCI1基因上的SNP rs37973引物及探针由美国ABI公司设计并合成(表1)。

1.3.2 Taqman PCR 将标准化制备成同一浓度后的DNA上机，按照绝对定量PCR文件的建立、进行重点读板文件的建立、进行背景荧光读取、进行绝对定量PCR、结果读取分析、Taqmqn Genotyper software软件分析等步骤，完成实时定量荧光PCR，进行数据分析。

1.3.3 实验数据分析 将Taqman实时定量荧光PCR中得到的数据资料应用PLINK软件进行logistic回归分析。

2 结果

分别统计各组中SNP rs37973最小等位基因位点出现的频率，比较各组中该等位基因位点有无统计学意义，数据分析结果，见表2。

表1 引物和探针序列

表2 SNP rs37973与实验组、对照组间的关联结果

3 讨论

自身免疫性大疱性皮肤病是一组以皮肤黏膜发生红斑、 水疱、 大疱、糜烂为临床特征的慢性复发性疾病，临床上最常见的为天疱疮、大疱性类天疱疮，糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗常有效。大疱性皮肤病的诊断必须以三个独立的诊断标准集合为基础，分别是临床特征、组织病理学检查和免疫学检查。

目前，糖皮质激素仍是自身免疫性大疱性皮肤病的第一线治疗药物，自其应用于临床以来，天疱疮[6]及大疱性类天疱疮的死亡率大大降低。治疗时应尽量遵循及时治疗、足量控制、正确减量、最小剂量维持的原则。虽然多数患者经糖皮质激素治疗能取得满意疗效，但有少数患者对大剂量糖皮质激素治疗反应很差或无反应，即使加大用量也不能控制病情的进展，病人预后较差。

2011年Tantisira等[3]通过全基因组关联分析在哮喘患者中揭示了一种新的影响吸入性糖皮质激素疗效的遗传药理学决定子。首先以家庭筛查算法为基础，从534290单核苷酸多态性(SNPs)中挑选有统计学效力小数目变异体进行分析，以确定吸入性糖皮质激素治疗反应时的肺功能变化。结果在SNP rs37972发现了一种显著、重复的相关性，此相关在4个独立人群含935人中重复出现(P=0.0007)。SNP rs37972在基因图谱中对应于糖皮质激素诱导的转录基因1(GLCCI1)，并与rs37973完全连锁不平衡。SNP rs37972和rs37973均与GLCCI1的表达减少相关。总体接受治疗受试者中，突变rs37973等位基因纯合子者一秒用力呼气量平均增加仅是接受相同治疗野生型等位基因受试者的1/3[(3.2±1.6)%与(9.4±1.1%)]，且其不良风险明显要高[OR=2.36，95%CI(1.27，4.41)]，基因型占总吸入性糖皮质激素反应变异性的6.6%。因此学者们得出结论功能性GLCCI1变异体与哮喘患者对吸入性糖皮质激素的反应明显下降相关。

GLCCI1基因位于7号染色体上，包括8个外显子，其广泛分布于肺细胞与免疫细胞中，且当有外源性糖皮质激素存在时，其表达量会大大增加。GLCCI1是糖皮质激素诱导细胞凋亡的早期标志之一[7]，而细胞凋亡又是减轻淋巴细胞、嗜酸粒细胞浸润的重要机制。若其表达减少可影响炎症细胞的凋亡，从而进一步导致机体对糖皮质激素敏感性降低。

迄今为止，已有不少学者在其它自身免疫性疾病中也发现类似现象，如强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、急性移植物抗宿主病等[4,5]。但本研究并未发现GLCCI1变异体与糖皮质激素不敏感存在显著相关性。推测可能的原因是种族异质性差异及样本量的不足。

综上所述糖皮质激素不仅参与调控体内免疫与炎性反应过程，而且调控个体基本的生命过程，为体内最重要的糖皮质激素，其在临床治疗中的应用也备受关注。因此，临床治疗中所出现的个体激素敏感性的不同及糖皮质激素不敏感甚至抵抗现象的研究也随之成为热点。相信随着人类基因组计划的不断完善，分子生物学技术的不断进步，多元化的基因检测技术诞生，不久的将来影响糖皮质激素敏感性的机制将最终被一一阐明。

[1] Hammers CM, Schmidt E, Zillikens D. Autoimmune blistering skin diseases: diagnostic and therapeutic approach[J]. Dtsch Med Wochenschr,2014,139(28-29):1473-1477.

[2] Kershenovich R, Hodak E, Mimouni D. Diagnosis and classification of pemphigus and bullous pemphigoid[J]. Autoimmun Rev,2014,13(4-5):477-481.

[3] Tantisira KG, Su JL, Harada M, et al. Genomewide association between GLCCI1 and response to glucocorticoid therapy in asthma[J]. N Engl J Med,2011,365:1173-1183.

[4] Szalai R, Matyas P, Varszegi D, et al. Admixture of beneficial and unfavourable variants of GLCCI1 and FCER2 in Roma samples can implicate different clinical response to corticosteroids[J]. Mol Biol Rep,2014,41:7665-7669.

[5] Meara AO, Boukouaci W, Robin M, et al. GLCCI1 and glucocorticoid receptor genetic diversity and response to glucocorticoid-based treatment of graft-versus-host disease[J]. Biol Blood Marrow Transplant,2015,21:1246-1250.

[6] Rosenberg FR, Sanders S, Nelson CT. Pemphigus. A 20-year review of 107 patients treated with corticosteroids[J]. Arch Dermatol,1976,112:962-970.

[7] Chapman MS, Qu N, Pascoe S, et al. Isolation of differentially expressed sequence tags from steroid-responsive cells using mRNA differential display[J]. Mol Cell Endocrinol,1995,108:R1-7.

(收稿：2016-04-12 修回：2016-08-27)

Lack of association between GLCCI1 variant and glucocorticoid sensitivity in Chinese patients with bullous diseases

DUTiantian1,2,FUXi'an1,SUNYonghu1,YUGongqi1,WANGZhenzhen1,YANGBaoqi1,LUXianmei1,LIUHong1,ZHANGFuren1.

l.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenerueology,ProvincialAcademyofMedicalScience,Jinan250022,China; 2.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China

ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective: To investigate the association between GLCCI1 gene and GC sensitivity in Chinese patients with bullous diseases. Methods: A total of 187 subjects were divided into GC-sensitive group (control dose ≤60 mg, n=129) and GC-insensitive group (control dose ≥150 mg, n=58). Single SNP (rs37973) was genotyped with TaqMan SNP Genotyping Assay Kit on the GeneAmp 7900 Sequence Detection System using specific TaqMan probes. The statistical analysis was performed using logistic regression in PLINK. Results: We failed to detect rs37973 variation in the patients with GC-insensitive bullous diseases (P=0.7881, odds ratio=1.062). Conclusion: There is no association between GLCCI1 and glucocorticoids sensitivity in Chinese patients with bullous diseases.

GLCCI1; glucocorticoids; bullous diseases

1山东省皮肤病性病防治研究所，济南，250022 2济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南，250062

张福仁，E-mail: zhangfuren@hotmail.com