XIAP和caspase-9在尖锐湿疣组织中的表达

李 晶 徐洪玉 吴振涛

·论著·

XIAP和caspase-9在尖锐湿疣组织中的表达

李 晶1徐洪玉1吴振涛2

目的： 检测XIAP和caspase-9在CA组织中的表达。方法： 采用免疫组化方法分别检测72例CA组织和20例正常包皮组织中XIAP和caspase-9蛋白的表达。结果： CA组织中XIAP蛋白的阳性表达率(56.94%)高于对照组(15.00%)，其差别有统计学意义(P<0.05)；而caspase-9蛋白的阳性表达率(37.50%)较对照组(70.00%)低，其差别亦有统计学意义(P<0.05)。两种蛋白在CA组织中的表达呈负相关(r=-0.83，P<0.05)。结论： XIAP抑制caspase-9的活性和表达，两者共同参与CA的发病过程。

尖锐湿疣； XIAP； caspase-9； 凋亡

尖锐湿疣(Condyloma Acuminatum, CA)是由人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus, HPV)感染引起的一种慢性良性增殖性疾病，临床上易反复发作，平均复发率高达40%[1]。角质形成细胞感染HPV后失去正常凋亡的功能，CA的发病和复发与此密切相关。其生物学行为类似良性肿瘤。Caspase家族的激活是细胞凋亡过程中的中心环节，X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中抑制凋亡最有力的成员，可直接结合并抑制凋亡起始因子caspase-9，caspase-9是线粒体凋亡通路中重要的启动者，可激活其下游的效应caspase，从而启动细胞死亡程序[2,3]。目前，有关XIAP 、caspase-9与CA的关系国内外报道鲜见。本研究采用免疫组化方法检测CA皮损中XIAP和caspase-9的表达，初步探讨其在CA发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料及分组 72例CA标本均来源于2014年6月至2015年4月山东省交通医院性病门诊就诊患者，皮损位于外生殖器部位。患者均为初次发病，就诊前未做任何治疗，无系统性疾病史，不合并有其他外生殖器疾病或性病。其中男42例，女30例，年龄20～45岁，平均年龄27.6岁，病程0.5～6个月，平均2.3个月。临床表现典型，醋酸白试验阳性，组织病理证实为CA(图1)。20例包皮标本作为对照组，取自我院泌尿外科行包皮环切术者，患者系健康男性，既往无CA等外生殖器疾病，经组织病理学检查证实为正常上皮。

1.2 试剂 兔抗人XIAP多克隆抗体、兔抗人caspase-9多克隆抗体及SV超敏两步法免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫组织化学染色 所有标本均连续切片3张，切片厚度4 μm，2张用于免疫组化研究，1张行HE染色，进行组织病理确诊。免疫组化操作均严格按照说明书步骤进行。用已知阳性标本做阳性对照，PBS代替一抗做空白对照(图2)。

1.4 结果判定标准 XIAP蛋白阳性染色定位于细胞浆或细胞膜，caspase-9蛋白阳性染色定位于细胞浆或细胞核。细胞阳性表达强度按照以下方法进行半定量分析：①按细胞着色强度：浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②按阳性细胞百分比：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分，两者分值的乘积即为细胞阳性表达强度，其分级方法为：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，6～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)，采用单盲法，每张切片任选两个皮片，每个皮片随机选取表皮层5个高倍(400倍)视野进行评分，取其得分的平均数作为该标本分值，将(+)-(+++)归为阳性表达组计算阳性率[4]。

1.5 统计学方法 运用SPSS 17.0统计软件，不同组间阳性率比较用Fisher确切概率法，两蛋白表达的相关性采用Spearman非参数相关分析，检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 XIAP在正常皮肤与CA组织中的表达 XIAP蛋白的表达情况见表1，CA组XIAP蛋白的阳性表达率(56.94%)较对照组(15.00%)高，其差别具有统计学意义(χ2=11.036，P<0.05)。

表1 XIAP在正常皮肤与CA组织中的表达

注：*与对照组相比，P=0.001

2.2 Caspase-9在正常皮肤与CA组织中的表达 caspase-9蛋白的表达情况见表2，CA组caspase-9蛋白的阳性表达率(37.50%)低于对照组(70.00%)，其差别具有统计学意义(χ2=6.692，P<0.05)。

表2 Caspase-9在正常皮肤与CA组织中的表达

注：*与对照组相比，P=0.012

图1 CA组织(HE,×100) 图2 CA组织的空白对照(×400) 图3 XIAP在正常皮肤组织中的表达，阳性细胞主要位于基底层及棘层中下部，数目较少，染色较浅，呈灶状分布(×400) 图4 XIAP在CA组织中的表达，阳性细胞分布于表皮全层，以棘层为主，染色较强(×400) 图5 Caspase-9在正常皮肤组织中的表达，阳性细胞主要位于增生上皮的基底层及棘层中下部，染色较强(×400) 图6 Caspase-9在CA组织中的表达，染色浅，表达较少(×400)

2.3 XIAP和caspase-9蛋白定位表达情况 XIAP蛋白阳性着色主要位于细胞浆或细胞膜。在正常皮肤组织中，阳性细胞主要位于基底层及棘层中下部，数目较少，染色较浅，呈灶状分布(图3)；而在CA组织中，阳性细胞分布于表皮全层，以棘层为主，染色较强(图4)。Caspase-9蛋白阳性着色在细胞浆或细胞核。在正常皮肤组织中，阳性细胞主要位于增生上皮的基底层及棘层中下部，染色较强(图5)；在CA组织中表达较少，着色较浅(图6)。

2.4 CA组织中XIAP和caspase-9蛋白表达的相关性分析 采用Spearman相关分析对二者在CA组织中的表达进行相关性分析，结果显示XIAP和caspase-9的表达呈负相关(r=-0.83，P<0.05)。见表3。

表3 XIAP和caspase-9蛋白表达的相关性

3 讨论

XIAP是Peter等于1996年在人的胚胎脑细胞中克隆出的IAP家族新成员，在体内除外周血淋巴细胞以外的所有组织中广泛表达[5]。XIAP分子N-端的3个BIR结构域可以直接结合和抑制caspases-3、caspases-7、caspases-9，是唯一能同时抑制起始阶段和效应阶段的凋亡抑制蛋白[6]。本研究发现，XIAP 在CA组织中表达高于正常皮肤组织，推测HPV感染宿主细胞后，可能激活了XIAP基因的转录、翻译，使XIAP蛋白过度表达，阻碍凋亡信号的传导，从而导致被感染的角质形成细胞避开凋亡、逃离生长监控，继而保护病毒自身的复制，促进CA的生长和发展。Yin等[7]报道XIAP在CA组织中表达的阳性率为80%，且均为较高水平表达，以棘层最为明显，本实验阳性率低于该报道。近年来，HPV的致癌性已得到证实，被HPV感染角质形成细胞的凋亡具有控制CA进一步发展的作用，Cillessen等在弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞中发现，XIAP的拮抗剂能恢复caspase-9介导的凋亡[8]，提示能够通过XIAP作为靶标研发治疗CA的新药物。

Caspases是一类半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族，该家族是执行细胞凋亡的主要酶类。其中caspases-9是线粒体通路中凋亡的启动者，激活其下游的效应caspases，最终导致细胞死亡。Caspases-9广泛表达于人类的正常组织如神经、肌肉等，在多种肿瘤组织中均发现caspase-9基因转录和翻译水平的下调[9，10]。本实验结果显示caspase-9在CA组织中低表达，与对照组相比差异具有统计学意义，提示caspase-9也参与了CA的发病过程。本实验还发现caspase-9与高表达的XIAP呈明显的负相关。我们推测，一方面，CA中caspase-9部分表达，可以使少数细胞发生凋亡，限制HPV的复制，这可能是机体的一种自我保护机制；另一方面，caspase-9的活性受到高表达的XIAP的抑制，细胞凋亡不能有效进行，HPV仍能保持较高水平的复制和繁殖，使越来越多的角质形成细胞被感染，促进病变组织不断生长。

综上所述，我们认为XIAP高表达及caspase-9活性降低共同参与CA的发生发展过程，它们之间的相互作用关系可能是细胞凋亡通路中重要的一个环节。已有研究报道，通过慢病毒介导的shRNA稳定抑制XIAP的表达，可以显著减少肿瘤细胞的增长、诱导凋亡并增加肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性[11-13]。因此，随着分子生物学技术的进一步发展，阻断XIAP的表达及上调caspase-9可能成为防止CA发生、复发的新靶点。

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(收稿：2016-06-24 修回：2016-08-16)

The expression of XIAP and caspase-9 in condyloma acuminatum

LIJing1,XUHongyu1,WUZhentao2.

1.DepartmentofDermatology,ShandongJiaotongHospital,Jinan250031China; 2.QingzhouSkinDiseaseControlStation,Qingzhou262500,Sandong,China

LIJing,E-mail:lijing810222@126.com

Objective: To detect the expression of XIAP and caspase-9 in condyloma acuminatum. Methods: The immunohistochemistry method was used to detect the expression of XIAP and caspase-9 in the tissues of 72 patients with condyloma acuminatum and prepuce tissues of 20 healthy persons. Results: The positive rate of XIAP protein in condyloma acuminatum was significantly higher than that in normal prepuces (56.94% vs 15%,P<0.05), while the positive rate of caspase-9 protein in condyloma acuminatum was lower than that in normal prepuces (37.5% vs 70%,P<0.05). There was a negative correlation between the expression of XIAP and caspase-9 (r=-0.83P<0.05). Conclusion: XIAP may promote the development of condyloma acuminatum by inhibiting the activity of caspase-9. The abnormal expression of XIAP and caspase-9 may be involved in the progression of condyloma acuminatum.

condyloma acuminatum; XIAP; caspase-9; apoptosis

1山东省交通医院皮肤科，济南,250031 2山东省青州市皮肤病防治站，青州,262500

李晶，E-mail: lijing810222@126.com