体外法与半体内法评价不同酶菌制剂处理后玉米秸秆主要成分降解率的比较试验

■毛建红 富丽霞 周 艳 解 彪 黄文琴 陶 莲 刁其玉*

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.中国农业科学院饲料研究所农业部饲料生物技术重点实验室奶牛营养学北京市重点实验室，北京 100081）

玉米秸秆作为反刍动物重要的粗饲料来源之一，在反刍动物日粮中占据很大的比例，具有来源广泛且价格低廉的特点。但因其自身复杂的细胞壁结构，直接作为饲料，适口性差、利用率低，在瘤胃中的降解率也较低[1]。近年来，如何提高秸秆类低质饲草的营养品质和利用率已成为畜牧业的研究热点[2-3]。生物制剂作为一种环保、高效的饲料添加剂深受畜牧业养殖者的青睐[4-5]。玉米秸秆经酶、菌制剂单独处理的研究报道较多，但是对酶制剂和菌制剂复合处理玉米秸秆的报道甚少，为了提高秸秆饲料的利用效率，有效发挥反刍动物的生长潜能，有必要对复合生物制剂（酶菌）处理后的玉米秸秆饲料的营养价值进行科学、有效的评定[6]。

体外产气法和半体内法是评价饲料营养价值常用的两种试验方法，但两种方法在测定不同的饲料对象时各有利弊。半体内法也叫尼龙袋法，可以将饲料的营养价值与瘤胃内微生物活动紧密联系起来，充分体现了反刍动物的动态消化生理特性，但并不适用于大批量样品的测定[7]。体外产气量在一定程度上代表饲料中可以被动物利用的有机物的含量，由于操作简单，重复性好，可进行大批量样品的测定，是目前国际上用来评定粗饲料营养价值的方法之一。

本文旨在探索不同酶菌制剂处理玉米秸秆，对干物质及粗纤维的降解率；同时也利用体外产气法和半体内法对其干物质降解率评定，并进行相关性分析，以期探讨利用体外产气法替代半体内法评定粗饲料干物质降解率的可能性，为优化评价方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料为玉米秸秆，取自河北省保定市，品种为金玉99，于2016年9月收货籽实后收割。采集的玉米秸秆经65℃烘干48 h后，一部分粉碎至40目用于营养成分测定和体外产气试验，另一部分粉碎至2 mm粒度后均匀混合，用于半体内试验。

酶制剂：复合酶制剂[纤维素酶（cellulase）+木聚糖酶（xylanase）+β-葡聚糖酶（β-glucanase）]、果胶酶（pectinase）、漆酶（laccase），试验所用复合酶制剂及酶均购自夏盛实业集团有限公司，粉末状，常温贮存。

菌制剂：植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）、布什乳酸杆菌（Lactobacillus buchneri），菌种保藏于中国农业科学院饲料研究所，菌制剂冻干粉于4℃冰箱保存。

1.2 试验设计（见表1）

表1 试验设计及样品编号

本试验共设计5个处理组，一个酶制剂处理组（CPL），两个酶菌制剂混合处理组（CPLP组和CPLB组），同时设置原料对照组（CON）和青贮对照组（CS）。

1.3 试验方法

1.3.1 青贮制作

玉米秸秆刈割后，用青贮切碎揉搓机切短至1～2 cm，按表1的处理组及添加剂量溶于蒸馏水，搅拌，均匀喷洒在粉碎的玉米秸秆上，将水分调节至65%～70%。样品均装入聚乙烯袋（24 cm×40 cm），每袋1 kg，用真空包装机（DZ-280/2SD）抽真空并封口，室温（25～37℃）贮藏45 d后开封取样。青贮对照组直接添加蒸馏水，不添加任何生物制剂。另取玉米秸秆原料样品置于冰盒中，迅速带回实验室，-20℃贮藏，待检。每个处理4个重复，3个用于样品测定，1个为备用。

1.3.2 营养成分含量测定

玉米秸秆的干物质（DM）、粗蛋白质（CP）参照张丽英[8]的方法测定，每个样品两个平行；中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）的测定参照Van Soest[9]的方法，每个样品3个平行。

1.3.3 体外产气试验

选用3只体况正常、健康、体重（52.0±2.3）kg、装有永久瘘管的杜泊×小尾寒羊F1代杂交羯羊，预饲期7 d，试验期4 d。羊单栏饲喂，自由饮水，每天饲喂2次（8:00和17:00）。于晨饲前1 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物，用4层纱布过滤于已预热的39℃保温瓶内迅速带回实验室。

体外产气法参照Menke[10](1988)方法。发酵采用DSHZ-300A水浴恒温振荡器装置，称取约200.00 mg样品，使用长纸条送入已涂抹凡士林的玻璃注射器中进行体外产气试验，每个样品3个重复，并设置3支空白管。采用Menke[10]的方法配制人工瘤胃液，并将人工瘤胃液与瘤胃液按体积比2∶1混合，作为培养液。通入CO2，同时用分液器向培养管中分装30.00 ml培养液，排除气泡，放置39℃恒温振荡培养箱中进行培养并计时。当培养至0、6、12、24、48、72 h时间点时，取培养管快速读取活塞所处的刻度值并记录。

1.3.4 半体内试验（尼龙袋技术）

选用6只体况正常、健康、体重(52.0±2.3)kg、装有永久瘘管的杜泊×小尾寒羊F1代杂交羯羊，随机分为2组，每组3只羊，每只羊为1个重复。试验羊单圈饲养，每日基础日粮供给量日粮精粗比为40∶60。每日于8：00和17：00饲喂两次，共1 200 g，自由饮水，预试期7 d。基础日粮组成及营养水平见表2。准确称取3 g不同处理的玉米秸秆青贮粉末，装入已知重量的10 cm×6 cm尼龙袋（孔径48 μm）中，每个样品设置2个平行，放置72 h后取出[11]。每个样品3个重复，每个重复1只羊。

1.4 参数模拟及统计分析

1.4.1 体外法产气量及产气参数

a.某一时间段培养管累计净产气量

净产气量=某一时间段产气量-对应时间段内3支空白管的平均产气量。

表2 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

b.体外法瘤胃干物质降解率计算

瘤胃干物质降解率(%)=(样本干物质重-残渣干物质重+空白干物质重)÷样本干物质重×100。

c.产气模型计算公式

Y=B(1-e-ct)。

式中：Y——t时间点200.00 mg干物质样本累积产气量(ml)；

B——200.00 mg干物质样本的理论最大产气量(ml)；

c——200.00 mg干物质样本的产气速度(h)。

1.4.2 半体内法瘤胃降解率测定及降解参数的计算方法

a.DM不同时间点的降解率

A（%）=（B-C）/B×100。

式中：A——待测饲料的某种营养成分瘤胃消失率(%);

B——待测样品中某种营养成分含量（g）；

C——待测样品尼龙袋残渣中某种营养成分含量（g）[12]。

b.DM降解参数及有效降解率

参照Фrskov等[13]提出的瘤胃动力学数学模型，计算降解率：

dP=a+b(1-e-ct)。

式中：dP——待测饲料的DM瘤胃某一时间的降解率(%)；

a——快速降解部分（%）；

b——慢速降解部分（%）；

c——慢速降解部分的降解速率常数（%/h）；

t——瘤胃内培养时间（h）。

有效降解率（ED，%）=a+bc/（k+c）。

式中：k——瘤胃外流速率，本试验中k值取0.031/h[14]。

1.5 数据处理与分析

试验数据经过Excel 2007初步整理以后，采用SPSS19.0的One-way ANOVA程序对玉米秸秆的营养成分、产气量及瘤胃降解率进行方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同酶菌制剂组合处理后玉米秸秆的营养成分(见表3)

表3 玉米秸秆及玉米秸秆生物处理后的营养成分

表3为不同处理的有效成分含量，可以看出DM含量以青贮对照组（CS）最低，各酶菌复合制剂组均显著高于青贮对照组（P＜0.05），其中以CPLB组的DM含量最高。与CON组相比，各处理组均显著降低了NDF、ADF的含量，CS组、CPL组、CPLP组和CPLB组的NDF含量分别降低了21.97%、21.83%、31.35%、31.55%，ADF含量分别降低了20.65%、22.07%、31.06%、31.30%，其中CS组与CPL组差异不显著（P＞0.05），CPLP组与CPLB组差异不显著，CPLB组与CPLP组显著低于CS组和CPL组（P＜0.05）。

2.2 体外产气试验结果(见表4)

表4 玉米秸秆及玉米秸秆生物处理后的产气量、产气参数及体外干物质降解率

从表4可以看出，各处理组0～72 h各时间点的产气量均随发酵时间的延长呈递增趋势。CPLP组在各时间点的产气量均是最大，CPLB组次之，但二者差异不显著（P＞0.05）。CPL组在0～12 h的产气量显著高于CS组（P＜0.05）。各处理组72 h的累计产气量从多到少依次为CPLP＞CPLB＞CPL＞CS＞CON，产气量分别为52.33、50.17、44.33、42.50、32.17 ml。理论最大产气量也以CPLP组最高（50.10 ml），与CPLB组（48.54 ml）差异不显著（P＞0.05），与CPL组、CS组、CON组差异显著（P＜0.05），体外产气速度由快至慢依次为CPLB＞CPLP＞CPL＞CS＞CON。

各酶菌处理组IVDMD24h和IVDMD48h均显著高于CON组（P＜0.05），CPLB组最高，其与CPLP组差异不显著（P＞0.05）。CPLP组和CPLB组显著高于CS组、CPL组和CON组（P＜0.05），CS组与CPL组的IVDMD24h差异不显著（P＞0.05），但CS组IVDMD48h显著高于CPL组（P＜0.05）。

2.3 半体内试验结果(见表5)

表5 玉米秸秆及玉米秸秆生物处理后的干物质降解率及有效降解率(%)

从表5可以看出，各处理组的DM降解率随着在瘤胃中培养时间的延长而不断增加。CPLB处理组的DMD72h比CON、CS、CPL的降解率依次提高了41.80%、15.26%、23.69%，CPLB组和CPLP组的DMD72h、瘤胃有效降解率互相接近（P＞0.05），均显著高于CPL组、CS组、CON组（P＜0.05）；CPL组与CS组的瘤胃有效降解率差异均不显著（P＞0.05）。0～6 h时，CPLB组的瘤胃降解率最大，为37.15%，显著高于CPL组、CS组、CON组（P＜0.05），与CPLP组差异不显著。在6～48 h，CON、CS、CPL、CPLP组降解变化明显，72 h时基本稳定。

2.4 半体内法与体外产气法干物质降解率的相关性分析(见表6)

表6 瘤胃干物质降解率与产气量及体外干物质降解率的相关性

从表6可以看出，各处理组的DMD24h和DMD48h与 GP24h、GP48h、IVDMD24h及 IVDMD48h均具有极显著的相关关系（P＜0.01）。比较分析表明，DMD24h与GP24h相关系数为0.827；DMD24h与IVDMD24h的相关系数为0.751；DMD24h与GP48h的相关系数为0.847；DMD24h与IVDMD48h的相关系数为0.745；DMD48h与GP24h的相关系数为0.804；DMD48h与IVDMD24h的相关系数为0.828；DMD48h与GP48h的相关系数为0.842；DMD48h与IVDMD48h的相关系数为0.830。

3 讨论

3.1 不同生物处理对玉米秸秆青贮品质的影响

由于秸秆细胞壁复杂的抗降解结构，往往单一的降解酶系或菌对秸秆的降解时间较长且不彻底，应用酶菌复合制剂处理秸秆，可以较大程度的发挥生物制剂的协同作用，达到快速降解秸秆纤维的目的[15]。本研究中，经过复合生物处理后，各处理组均不同程度的降低了玉米秸秆中的NDF和ADF的含量。Wang等[16]研究报道，添加外源纤维素酶可以增加瘤胃微生物的活性，提高饲料消化率和动物生产性能。植物乳酸菌和布氏乳杆菌可以提高青贮过程中活菌数量，有利于青贮发酵品质。李静[17]研究发现，青贮水稻秸秆中添加乳酸菌和纤维素酶复合制剂，处理效果优于单独添加乳酸菌或纤维素酶处理，可使NDF和ADF含量分别降低3.61%和3.05%。饲料中的粗蛋白质含量是评价粗饲料营养价值的重要指标之一。本研究中，经过生物处理后的玉米秸秆，CP含量均有下降，这可能是由于青贮发酵过程中消耗了一部分CP导致。陶莲等[11]认为玉米秸秆青贮后CP含量下降是由于NH3-N含量提高所致。王玉荣[4]应用复合酶制剂+果胶酶+漆酶处理水稻秸秆，其测定的CP含量明显低于对照组，本试验结果与其相似。

3.2 体外法评价玉米秸秆酶菌处理的效果

通常情况下，体外产气量可以在某种程度上反映饲料在反刍动物瘤胃中的降解特性。本研究中，72 h产气量和理论最大产气量以CPLP组最大，显著高于CON组、CS组和CPL组，与CPLB组差异不显著。饲料中可利用的有机物含量越多，瘤胃的产气量就越高。经过生物处理，秸秆的营养物质被有效地保存下来，酶菌复合制剂作用于细胞壁结构，破坏了纤维素-半纤维素-木质素形成的顽固的抗降解结构，增加了瘤胃微生物附着的比表面积[15]。CON对照组的产气量和产气速率都明显低于其他处理组，这是由于秸秆在自然保存的状态下，营养物质流失，可发酵利用的有机物质较少导致。但是产气量并不能直接衡量饲料之间的降解程度，还需结合DM和NDF降解率等指标综合评定饲料的营养价值[18]。体外干物质消失率可以反映饲料消化的难易程度[19]。本研究中，24 h和48 h的体外干物质降解率均为CPLB组高于其他处理组，但与CPLP组差异不显著。CPL组体外干物质降解率在24 h时与CS组差异不显著，在48 h显著低于CS组，但是产气速率明显高于CS组，这可能是由于底物中可利用的有机物质在发酵前期与瘤胃微生物充分反应导致。Salem等[20]研究表明，纤维素酶和木聚糖酶混合处理玉米青贮，可以提高体外产气量和体外干物质降解率。Li等[21]研究发现在玉米秸秆青贮中添加植物乳杆菌，可以提高青贮发酵品质并且提高了体外干物质降解率，本研究结果与其一致。

3.3 半体内法评价玉米秸秆酶菌处理的效果

瘤胃DM降解率是影响干物质采食量（DMI）的一个主要因素，且DM降解率与DMI存在正相关关系。DM降解率高，则有利于生产性能的发挥，同一种饲料在瘤胃中停留时间长，则降解率较高，反之，则降解率较低[22]。本试验结果表明，经酶菌复合制剂处理组（CPLP、CPLB组）处理后的玉米秸秆DM瘤胃降解率显著高于复合酶制剂处理组（CPL）及玉米秸秆青贮对照组（CS）。Patel等[23]研究报道，添加外源纤维素酶可以破坏细胞壁的β-1,4糖苷键，提高纤维饲料的瘤胃降解率。门宇新[24]利用尼龙袋法测定水稻青贮的DM降解率，发现随着乳酸菌制剂用量的增加，水稻青贮饲料的DM降解率呈上升趋势。王玉荣[4]研究表明，尼龙袋试验中添加复合酶菌制剂可以显著提高水稻秸秆72 h DM降解率，原因是酶菌复合处理玉米秸秆，使其纤维结构破坏，秸秆软化，使得微生物更易利用。

3.4 体外产气法与半体内法评价玉米秸秆品质的关联性分析

体外产气法测得的产气量是基于秸秆中可发酵物质所得的结果，底物中碳水化合物越多，产气量越高；尼龙袋法测定的DM降解率与秸秆饲料中可消化的营养物质存在一定的相关性，两种试验方法在评定饲料的营养价值时存在一致性。本试验中，通过半体内试验测定的DM降解率和体外产气试验测定的产气量综合分析，CPLB组与CPLP组效果最好。经相关性分析，玉米秸秆DMD24h、DMD48h分别与GP24h、GP48h、IVDMD24h、IVDMD48h存在极显著正相关关系。洪金锁等[25]对青海燕麦青干草饲养价值的研究中也表明，半体内法和体外产气法测得的干物质降解率呈正相关关系，得出相关系数R2=0.98。本试验中，DMD24h与IVDMD24h、IVDMD48h的相关系数为0.751、0.745，DMD48h与IVDMD24h、IVDMD48h的相关系数为0.828、0.830。靳玲品[26]研究表明，粗饲料24 h体外消化率与其24 h瘤胃消失率呈显著正相关关系，但结果偏低，可能是因为样品可溶的部分或颗粒过小从尼龙袋逃逸导致。谢春元等[27]研究表明，半体内试验和体外产气试验各有利弊，彼此的相关性受饲料类型的影响。本研究中发酵底物均为玉米秸秆，所以两种试验方法测得的结果相关性较高。张文璐等[28]运用体外产气法和半体内法评定玉米秸秆干物质降解率的研究中表明，体外产气量与体内干物质降解率呈高度正相关。本研究中，DMD24h与GP24h和GP48h的相关系数为0.827、0.847，DMD48h与 GP24h和 GP48h的相关系数为0.804、0.842，呈极显著正相关关系，说明可以用体外产气法替代半体内法来评价玉米秸秆品质。

4 结论

①玉米秸秆经过酶菌生物制剂处理后，有效降低了秸秆中NDF、ADF的含量，有效地改善了玉米秸秆的品质。

②酶菌复合制剂处理后（CPLP、CPLB）的玉米秸秆，体外产气量、体外干物质降解率、半体内干物质降解率均显著高于青贮对照组(CS)，说明酶菌复合制剂处理后，玉米秸秆中可利用的有机物增多，秸秆利用率得到提高。

③ DMD24h、DMD48h分别与GP24h、GP48h、IVDMD24h、IVDMD48h存在极显著正相关关系，说明体外产气法和半体内法测定的试验结果存在高度相关性，用体外产气法替代半体内法来评价玉米秸秆的有效成分降解率是可行的。