热应激对畜禽肠道黏膜屏障功能影响及其损伤修复研究进展

■周加义 高春起 严会超 王修启

（华南农业大学动物科学学院广东省动物营养调控重点实验室国家生猪种业工程技术研究中心，广东广州 510642）

肠道是机体连通外界的媒介，具有消化、吸收营养物质及抵御外来病原体和毒素侵袭的双重作用。肠道黏膜每天会接触大量有害物质，正常情况下，肠道黏膜屏障可有效阻止这些有害物质穿过上皮层进入机体内其它组织器官和血液循环，以保证机体代谢的正常进行。

然而，伴随着集约化条件下畜禽养殖密度的增加及全球气候逐步变暖，热应激已成为影响畜禽夏季生产性能的重要因素。有研究表明，肠道是应激反应的中心器官[1]，尤其对热应激极为敏感[2]。当畜禽处于持续高温下，机体出于自我保护的目的，会重分配体内血液流量，由此带来的后果是流经胃肠道的血量急剧减少，胃肠道严重缺血缺氧，导致上皮细胞脱落、坏死，屏障功能被破坏，黏膜通透性增加。此时病原菌和毒素等便可通过受损的肠道黏膜进入血液循环，引起有害菌的迁移和移位，进而诱发肠炎、败血症及多脏器功能衰竭综合征[3]。

因而寻找可有效缓解热应激对肠道屏障损伤的功能性物质，已成为研究者和养殖者亟待解决的难题。目前，研究发现，谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、纤维寡糖、阿魏酸等功能性物质对热应激都有一定程度的缓解功效[4-7]。本文总结了近年来热应激对肠道屏障功能的影响及其营养调控的研究进展，以为解决这一问题提供思路。

1 热应激对肠道黏膜屏障功能的影响

传统的肠道黏膜屏障主要指肠黏膜上皮细胞及其紧密连接等构成的机械屏障。随着研究的深入，肠道黏膜免疫屏障、化学屏障和微生物屏障陆续被揭示。这4种屏障功能（如图1所示）以完整的肠黏膜上皮、肠道内正常菌群、肠道内分泌物等为依托，通过不同的分子调控机制及信号通路构成一个有机整体发挥作用，形成了抵御体外抗原物质、有害微生物侵袭的第一道防线。其中最为关键的是肠道黏膜机械屏障和免疫屏障[7]。

图1 肠道屏障的组成[8]

目前，评估畜禽肠道黏膜屏障功能的方法主要包括肠道通透性、血浆或血清中内毒素、细菌移位状况测定，以及肠道黏膜结构观察等。通过这些指标的测定可间接反映肠道黏膜屏障受损情况。特别是肠道黏膜通透性异常与否被认为是反映肠道屏障功能最主要的指标。

1.1 机械屏障

肠道上皮细胞间紧密连接的通透性决定肠黏膜的机械屏障功能[9]。其中闭合小环蛋白(ZO)是紧密连接支持结构的基础，闭合蛋白（claudins）为紧密连接的结构骨架[10]。这些紧密连接蛋白分子的密闭程度会因外界刺激而发生改变[11]。在热应激状态下，猪小肠黏膜内紧密连接蛋白ZOs和claudins等表达量降低，并且在黏膜内会重新分配和定位[12]，导致肠道紧密连接松弛，上皮内组织直接暴露在抗原或细菌面前（如图2所示）。

高温应激可使畜禽肠黏膜机械屏障功能受损，导致肠道通透性增加，肠黏膜中某些组分改变，因此通过测定这些指标可间接反映小肠黏膜的紧密连接状况。有研究者对肉仔鸡[13]和生长猪[14]热应激处理后均发现细胞对异硫氰酸荧光素右旋糖酐（FD4）的渗透率增加，跨膜电阻（TER）降低，说明肠道黏膜机械屏障受到了损伤。此外哺乳动物小肠黏膜绒毛上皮细胞中特异性表达的二胺氧化酶（DAO）含量变化也是反映小肠黏膜机械屏障功能较为理想的指标。刘凤华[15]发现中国实验用小型猪高温刺激10 d后小肠黏膜受损严重，绒毛高度下降，并且黏膜上皮细胞释放大量的DAO进入血液，使血中DAO含量升高，十二指肠、空肠黏膜中DAO含量显著下降，说明高温应激引起小肠黏膜组织损伤，导致黏膜机械屏障被破坏。

图2 肠道机械屏障[8]

1.2 免疫屏障

肠道黏膜免疫屏障主要由肠道相关淋巴样组织（GALT）、肠系膜淋巴结（ETC）、分泌型抗体构成，其中肠道相关淋巴样组织主要包括上皮内淋巴细胞（IEL）、固有层淋巴细胞（LPL）和派氏集合淋巴结（PP）及散布于整个肠壁中的巨噬细胞、淋巴细胞等，分泌型抗体的主要成分是免疫球蛋白A（IgA）（如图3所示），它们通过肠道免疫系统细胞群的细胞免疫作用及体液免疫作用保护肠道免受外来抗原的破坏和异常的免疫应答[17]。

图3 肠道免疫屏障[16]

Toll样受体（TLRs）作为先天免疫系统中广泛表达的免疫蛋白，可激活核转录因子-κB（NF-κB）和细胞因子（cytokines）等靶基因参与肠道炎症反应和免疫应答[18-19]。此外，IEL可通过分泌多种细胞因子发挥抗菌、抗毒素作用，在肠道免疫屏障中起到免疫监控和免疫防御的作用，而LPL包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等，可产生大量分泌型抗体或直接吞噬病原体加强肠道黏膜免疫屏障。因此，TLRs表达水平的高低、肠道内免疫细胞的种类和数量变化均可用于评价肠道黏膜免疫屏障情况。Liu等[20]和Deng等[21]研究表明，温热应激可降低肠道黏膜内TLR2和TLR4的表达，减少回肠IEL等免疫细胞的数量，表明热应激能使肠道黏膜免疫屏障功能减弱。张相伟[22]也发现随着热应激时间的延长，鸡肠道IEL数量和分泌型免疫球蛋白A（sIgA）细胞平均光密度逐渐降低，提示热应激通过减少肠道免疫细胞的数量和免疫因子的分泌，进而降低动物肠黏膜免疫屏障功能。

热应激还可引发肉仔鸡小肠多灶性淋巴浆细胞性肠炎，并使感染沙门氏菌肉仔鸡的肠道免疫屏障遭到破坏，导致沙门氏菌通过肠道黏膜迁移到脾脏，加重小肠壁炎性浸润[23]。Niu等[24]在38℃高温环境下持续饲养肉仔鸡，同样发现热应激可使巨噬细胞的吞噬能力显著下降，破坏肉仔鸡的肠道免疫屏障。

1.3 化学屏障

肠道化学屏障主要由覆盖在肠上皮细胞上的含一定数量微生物的疏松黏液外层和含少量微生物的黏液内层组成[25]。肠道分泌的消化液可稀释毒素，冲洗肠腔，并使致病菌难以黏附或定植于肠上皮。肠道中某些分泌型细胞，如杯状细胞可分泌含糖蛋白和糖脂的黏液，这些成分能使细菌与糖蛋白和糖脂结合后随粪便排出[26]，也有一些细胞分泌的黏液含有补体成分可增加溶酶菌及免疫球蛋白的抗菌作用。Shi等[27]发现蛋鸡热应激后，小肠绒毛内杯状细胞的数量呈下降的趋势，导致黏液分泌不足，肠道化学屏障作用减弱。Xue[28]将35日龄蛋鸡在高温条件下饲养1～10 d，结果显示，短时间热应激处理后黏膜中杯状细胞数量增加，但随着热应激时间的延长，杯状细胞数量也呈现下降趋势。此外，小肠绒毛刷状缘碱性磷酸酶（ALP）可清除肠道有害微生物产生的脂多糖等内毒素作用，发挥肠道黏膜化学屏障功能[29]。Li等[30]证实高温处理蛋鸡后ALP活性显著降低，与Pearce等[31]在猪上的研究结果相一致。

1.4 微生物屏障

小肠黏膜微生物屏障是由肠道共生菌与宿主形成的相互作用、相互依赖的微生态平衡系统。这些共生菌参与了肠道中大部分的新陈代谢活动，影响肠上皮细胞的更新过程，同时其能在肠道黏膜表面形成一道保护性的微生物屏障，阻止致病菌在肠上皮细胞的黏附和定植。

越来越多的证据表明，肠道微生物对于肠道稳态的维持至关重要。当畜禽处于热应激条件下，肠道菌群结构平衡失调，微生物系统遭到破坏，有害微生物便开始在肠道中定植[32-33]。Song等[13]和He等[34]均发现，热应激可使肉鸡肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌的数量降低，大肠杆菌、沙门氏菌及荚膜梭菌的数量增加。此外，Li等[33]通过对高温处理的蛋鸡各肠段微生物区系进行比对，发现热应激对空肠的微生物菌群影响最为明显。而其在肉鸡上的试验则表明热应激条件下回肠中菌群的多样性较为丰富，随着热应激的持续，对回肠的菌群影响较大，共生菌群以外的菌群较为丰富[35]。说明高温应激对功能不同的鸡各肠段微生物区系影响存在差异，但是均会增加肠道外来菌群的种类和数量。

2 缓解热应激损伤肠道黏膜屏障的营养调控

热应激破坏肠道黏膜屏障，降低畜禽生产性能，给畜牧业造成了巨大损失。因此，研究热应激状态下畜禽肠道黏膜屏障功能的变化及其缓解措施较为重要。近年来，通过营养调控措施缓解畜禽热应激取得了较大进展，包括补充某些功能性氨基酸、寡糖、微量元素和中草药饲料调剂等，均有较好的效果。

2.1 功能性氨基酸

2.1.1 谷氨酰胺

谷氨酰胺是肠上皮细胞和淋巴细胞主要的能量来源，可满足上皮细胞和淋巴细胞快速增殖和修复的需要，充分保证肠道正常发育。当畜禽处于热应激状态时，内源性谷氨酰胺不能满足机体需要，额外添加谷氨酰胺对促进肠道屏障修复有一定积极作用[36]。Dai等[37]的研究表明，在热应激组肉鸡饲粮中外源添加0.5%和1.0%的谷氨酰胺后，可增加肉鸡绒毛高度，缓解肠道结构损伤[37]。康磊等[38-39]研究发现，日粮中添加谷氨酰胺可显著提高不同日龄热应激肉鸡十二指肠、空肠、回肠黏膜上皮内淋巴细胞的数量及sIgA含量，降低血液中内毒素、白介素-1和肿瘤细胞坏死因子的含量，可改善热应激肉鸡的肠道免疫性能。谷氨酰胺改善热应激条件下家禽黏膜屏障的研究较多，而在猪和反刍动物上的研究较少，具体效果有待研究证实。

谷氨酰胺可降低热应激引起的肠黏膜通透性变化，维护肠上皮细胞的紧密连接结构，进而抑制细菌的入侵，并大幅度增强肠道黏膜免疫性能，提高淋巴细胞、吞噬细胞功能[40]。有报道称谷氨酰胺是通过PI3K/Akt信号通路来调控细胞内紧密连接的完整性[41]，进而影响到肠道黏膜屏障功能的；也有研究者认为其是通过下调NF-κB信号通路来实现[42]。

2.1.2 γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，作为哺乳动物神经系统中广泛存在的一种抑制性神经递质，具有较好的抗应激作用。Chen等[43-44]研究表明，热应激可破坏雏鸡小肠的正常黏膜组织结构的完整性，降低消化酶活性，减弱肠道黏膜的免疫屏障，而GABA可有效缓解热应激造成的这些损伤，保护肠黏膜的完整性，并且在一定程度上能促进淋巴细胞的增殖，维持小肠黏膜正常的免疫能力。

GABA在热应激情况下对动物肠道正常结构和功能的维持，可能存在两个途径：一方面可能是通过直接转化成谷氨酰胺，进而增强肠道黏膜的修复速度，缓解小肠结构的改变，维护小肠的物理屏障[45]。另一方面，GABA可能通过促进小肠黏膜中白细胞介素7（IL-7）和分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的分泌，进而增强肠道免疫屏障的功能[46]。

2.2 功能性寡糖——纤维寡糖

功能性寡糖具有促进有益菌增殖、改善肠道菌群、激活机体免疫系统等多种生理功能，主要包括甘露寡糖、果寡糖、壳寡糖等。纤维寡糖作为一种新型的功能性寡糖，来源丰富，价格低廉，应用前景较好。有研究表明，在热应激处理的肉仔鸡饲粮中添加纤维寡糖可降低旁细胞通路的通透性，缓解热应激造成的肠道黏膜屏障损伤[5]。Xu[47]研究指出，在生长猪饲粮中添加0.2%的纤维寡糖可以提高生长猪的生长性能，刺激结肠肠道有益菌的增殖并抑制有害菌的增殖，改善结肠黏膜屏障。此外，Hong等[48]也证实纤维寡糖可缓解热应激对肠道黏膜屏障功能的损伤，且纤维寡糖与益生菌组合添加效果更好。

2.3 中草药饲料调剂

阿魏酸属酚酸，是阿魏、川芎、当归等中草药的有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种功效。He等[49]发现，阿魏酸可有效抑制热应激诱导的小肠黏膜通透性增加，改善热应激诱导的小肠紧密连接结构的破坏，并证实阿魏酸是通过抑制MAPK和NF-κB信号通路的激活，减少炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的释放，从而达到缓解热应激诱导的肠黏膜屏障损伤的作用。

徐光科[50]研究表明，蕾香、苍术等有效成分组成的清凉颗粒可有效调节高温下鸡免疫器官中上皮内淋巴细胞、杯状细胞数量，促进热应激小肠黏膜内IgA的表达。刘凤华[15]研究发现，清凉颗粒可通过减少热应激生长猪小肠上皮结构损伤，加快黏膜上皮细胞更新与修复，维持肠道屏障的完整性。同时，通过蛋白质组学分析发现，这种抗损伤机制除了与表皮生长因子/表皮生长因子受体（EGF/EGFR）在转录水平上表达增加有关外，还与细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/ERK2）介导的信号通道密切相关。

2.4 其它营养调控

缓解热应激的营养调控物质种类及数量繁多，除上面几种外，还包括一些活性多肽（如EGF）、微量元素（如锌制剂）、益生元、酶制剂等都有改善肠道屏障功能的作用，但其缓解机制仍需进一步探索。

3 总结与展望

肠道机械、免疫、化学、微生物这4种屏障相互关联、相互渗透，构成了肠道黏膜屏障这一有机整体，保护机体不受外来病原菌入侵。高温作为一种最为常见的环境应激因子之一，对畜禽肠道黏膜屏障的完整性造成了极大破坏。目前，关于热应激影响肠道黏膜屏障及其通过营养调控的损伤修复机制尚不明确，特别是对参与屏障功能的MAPK、ERK、NF-κB等信号转导过程及各信号之间的关联方式均有待进一步研究。未来肠道黏膜屏障功能的营养调控机制将趋于向多动物类型、多组织器官、多细胞系和类肠团模型相结合等多层次方向发展。相信通过深入、系统研究，终将揭开热应激损伤肠道黏膜屏障及其调控机制的神秘面纱，从而为动物肠道健康的改善提供科学依据。