山柰醋炙前后对甲氧基肉桂酸乙酯含量与抗感染镇痛作用变化研究

吴艳婷,陈桂添,时军,郭嘉俊

(广东药科大学 中药学院,广东 广州 510006)

天然药物化学

山柰醋炙前后对甲氧基肉桂酸乙酯含量与抗感染镇痛作用变化研究

吴艳婷,陈桂添,时军,郭嘉俊

(广东药科大学 中药学院,广东 广州 510006)

目的 比较山柰醋炙前后水提物和醇提物的抗感染镇痛作用差异,同时测定提取物中对甲氧基肉桂酸乙酯的质量分数。方法 采用HPLC法测定对甲氧基肉桂酸乙酯质量分数,采用热板法和二甲苯致小鼠耳廓肿胀法对比山柰提取物的抗感染镇痛作用。结果 山柰各提取物中对甲氧基肉桂酸乙酯质量分数大小顺序为醋炙醇提物>生品醇提物>醋炙水提物>生品水提物。与生理盐水组比较,山柰提取物均能显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀度(P<0.01),能不同程度地提高小鼠的痛阈值(P<0.05或P<0.01)；醋炙醇提物组的抗感染镇痛作用均高于生品水提物组(P<0.05)。结论 醋炙后，山柰提取物中对甲氧基肉桂酸乙酯质量分数显著增加,抗感染镇痛作用增强,对甲氧基肉桂酸乙酯可能是山柰抗感染镇痛作用药效成分之一。

山柰； 醋炙； 抗炎镇痛； 高效液相色谱法

山柰系姜科山柰属植物山柰KaempferiagalangaL.的干燥根茎,作为一种药食同源的传统中药,性辛、温,有温中化湿、散寒、行气止痛、除湿辟秽的功效,主治胸脘胀满、心腹冷痛、寒湿吐泻、消化不良、风虫牙痛、风湿关节痛、跌打损伤等证[1-3]。现代研究表明,山柰中主要含有挥发油[4-6]、山柰酚[7]等活性成分。2015年版《中国药典》规定山柰含挥发油不得少于4.5%。对甲氧基肉桂酸乙酯是山柰挥发油中的主要有效成分之一,具有镇痛、抗感染、抗癌、抑菌、防晒等作用[8]。

中医理论认为,醋炙能引药入肝,具有疏肝散癖活血、理气止痛的作用[9]。李时珍《本草纲目》记载：“治疗心腹冷痛,山柰、丁香、当归、甘草等份,为末,醋糊丸梧子大。每服三十丸,酒下,集简方[10]。”此外,民间多用川芎与山柰醋炙后治疗膝关节骨质增生,疗效良好[11-12]。本文通过比较山柰醋炙前后的镇痛抗感染效果,考察醋炙前后对甲氧基肉桂酸乙酯质量分数的变化,归纳总结其量效关系,以期为醋炙山柰的抗感染镇痛应用提供科学理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DIONEX Ulti Mate 3000高效液相色谱系统(赛默飞世尔科技中国有限公司)；RE-2000A型真空旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHE-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；202-2AB型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；PHS-25型酸度计pH计(上海雷磁仪电科学仪器有限公司)；BP211D型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

山柰药材(安徽归然药业有限公司,批号20160103,经广东药科大学中药学院马鸿雁副教授鉴定为姜科植物山柰KaempferiagalangaL.的干燥根茎)；对甲氧基肉桂酸乙酯对照品(中国食品药品检定研究院,批号110835-201202,质量分数>98%)；老陈醋(山西四眼井酿造实业有限公司,批号20150910,总酸质量浓度以乙酸计≥5.00 g/100 mL)；对乙酰氨基酚片(成都德通药业有限公司,批号20150806)；甲醇(色谱纯,Merk KgaA)；二甲苯、冰乙酸、乙醇等均为分析纯,水为蒸馏水。

1.3 动物

SPF级KM小鼠,体质量(20±2)g,雌雄不分,由广州中医药大学实验动物中心提供,许可证号SCXK(粤)2016-0002。

2 方法与结果

2.1 山柰提取物的制备

取山柰饮片适量,根据2015年版《中国药典》醋制规范,每100 kg净山柰药材加入老陈醋20 kg,拌匀,闷润至醋被吸尽后,置炒制容器内,用文火加热炒干,取出放凉,即得山柰醋炙品。取山柰生品、山柰醋炙品各适量,粉碎成粗粉,过1号筛,分别以10倍量的蒸馏水和70%(体积分数)乙醇为溶剂,冷凝回流提取3次,前2次回流2 h,第3次回流1 h,趁热抽滤后合并滤液,减压回收水和乙醇至浸膏状。生品水提组、生品醇提组、醋炙水提组、醋炙醇提组的得率分别为62.64%、18.77%、54.58%、28.63%。将所得山柰提取物密封,置于4 ℃保存备用。

2.2 山柰提取物中对甲氧基肉桂酸乙酯的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-质量分数0.5%(pH=2.3)磷酸水溶液(体积比60∶40)；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃,进样量：20 μL。在此条件下,对照品溶液、供试品溶液的色谱图见图1,对甲氧基肉桂酸乙酯的保留时间为(26.35±0.05)min,表明方法专属性强,其他物质无干扰。

2.2.2 对甲氧基肉桂酸乙酯对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒质量的对甲氧基肉桂酸乙酯对照品2.47 mg,置5 mL量瓶中,加50%(体积分数,下同)甲醇适量,超声30 min溶解,加50%甲醇定容至刻度,摇匀,0.22 μm微孔滤膜滤过,配制成质量浓度为494 μg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 分别精密称取各组别的总浸膏0.50 g,置于10 mL离心管中,加入50%甲醇适量超声(功率70 W,温度50 ℃,时间20 min),3 000 r/min离心30 min,收集上清液移至25 mL容量瓶中,加50%甲醇定容,摇匀,过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

2.2.4 方法学考察 精密量取“2.2.2”项配制的对甲氧基肉桂酸乙酯对照品溶液,用50%甲醇稀释成浓度分别为4.94、9.88、14.82、19.76、29.64、34.58、39.54 μg/mL的系列标准样品浓度,在上述色谱条件下重复进样3次,测定峰面积,以峰面积平均值为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归,得线性方程为Y=1.367 7X+0.062 23,r=0.999 5,结果表明对甲氧基肉桂酸乙酯在4.94～39.54 μg/mL之间具有良好的线性关系。日内精密度、日间精密度、重复性、24 h内稳定性试验的RSD分别为0.13%、0.15%、0.39%、0.55%,表明仪器的精密度和重复性良好,样品在24 h内稳定性良好。样品中对甲氧基肉桂酸乙酯的平均回收率为98.96%,RSD=0.72%(n=6),表明样品的回收率符合要求。最小检测限为12.37 ng/mL,信噪比(S/N)约为3∶1。定量限为98.50 ng/mL,信噪比(S/N)约为10∶1。

t/min200150100500-501751257525-201-26.3971-26.3221-26.3651-26.4001-26.288250200150100500-5010152025303505BACEDmAUmAUmAU

A.对甲氧基肉桂酸乙酯对照品; B.生品水提物样品;C.生品醇提物样品; D.醋炙水提物样品; E.醋炙醇提物样品。

图1 山柰中对甲氧基肉桂酸乙酯的HPLC

Figure 1 HPLC chromatograms of Ethylp-methoxy cinnamate inKaempferiaRhizoma

2.2.5 样品的测定 取各组别的总浸膏0.50 g,精密称定,按“2.2.3”项下方法处理,依上述色谱条件分别测定3次,记录峰面积,取平均值，结果测得生品水提组中对甲氧基肉桂酸乙酯的质量分数为(2.601 3±0.07)μg/g，生品醇提组为(33.541 1±1.9)μg/g，醋炙水提组为(6.109 4±0.6)μg/g，醋炙醇提组为(62.861 9±1.5)μg/g。可见，经醋炙后，山柰提取物中对甲氧基肉桂酸乙酯的质量分数明显增加。

2.3 小鼠的抗感染镇痛试验

2.3.1 小鼠热板法的镇痛试验 取健康昆明种雌性小鼠,将智能热板仪温度调至(55±0.5)℃,预热10 min后,将雌性小鼠每次1只放在热板上,小鼠自放上至出现舐左后足所需时间作为该鼠的痛阈值,将筛选合格(舔足时间在5～30 s)的雌性小鼠100只,分10组,每组10只,分别为生理盐水组(0.2 mL/10 g)、对乙酰氨基酚阳性对照组(58 mg/kg),生品水提组、醋炙水提组、生品醇提组、醋炙醇提组各分别设高、低剂量组(按生药计为1 750、875 mg/kg)。每组给药前重复测定痛阈值,取2次痛阈平均值作为正常痛阈值。适应性喂养3 d后给药,按不同组别进行相应药物灌胃,每天1次,连续给药7 d。末次给药后分别于30、60、90 min测量小鼠的痛阈值,计算各组给药后的痛阈提高百分率,结果以SPSS22进行组间t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P<0.05为有统计学意义。

结果见表1。可见,对乙酰氨基酚、山柰提取物均能不同程度地提高热板法疼痛模型小鼠痛阈值、减少疼痛反应次数,镇痛效应与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；醋炙醇提组的镇痛作用优于生品水提组(P<0.05)；生品水提组在90 min时,痛阈值提高百分率无统计学意义(P>0.05)。

2.3.2 二甲苯致小鼠耳廓肿胀法的抗炎试验 取健康昆明种小鼠100只,雌雄各半,分10组,每组10只,分组及给药方式同“2.3.1”项。于末次给药0.5 h后,将0.02 mL二甲苯均匀涂于每只小鼠右耳耳廓两面致炎,左耳不涂作为正常对照。1 h后脱颈处死,沿耳廓基线剪下双耳,用直径8 mm打孔器取左右耳同一部位圆耳片,用电子天平称定质量,以右耳质量减去左耳质量为肿胀度,计算耳肿胀度及肿胀抑制率。结果以SPSS22进行组间t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P<0.05为有统计学意义。

结果见表1。可见,对乙酰氨基酚、生品水提组、生品醇提组、醋炙水提组、醋炙醇提组对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀均有明显的抑制作用,二甲苯诱发耳廓肿胀度与生理盐水组比较有统计学意义(P<0.01)。醋炙醇提高剂量组与生品水提低剂量组比较有统计学意义(P<0.01),即醋炙醇提取物比生品水提取物的抗感染作用更明显,表明醋炙能增强山柰的抗感染作用。

表1 山柰不同提取物的抗感染镇痛作用比较

与生理盐水组比较：*P<0.05,**P<0.01；与生品水提物低剂量组比较：▲P<0.05,▲▲P<0.01。

3 讨论

挥发油类和黄酮类成分是山柰中公认的有效成分，但具体的抗感染镇痛成分目前尚未完全明确[13-14]。前期研究发现,对甲氧基肉桂酸乙酯是山柰挥发油中质量分数最高的特征性成分,具有抗感染、镇痛、抗癌、防晒等药理活性,是山柰药材质量控制的指标性成分[15],因此选择对甲氧基肉桂酸乙酯作为本文的考察指标[15-16]。

本文研究结果表明,山柰经醋炙后,提取物中对甲氧基肉桂酸乙酯的质量分数明显增加,抗感染及镇痛作用增强。醋炙醇提物中对甲氧基肉桂酸乙酯的质量分数最高，且抗感染及镇痛作用强度与对乙酰氨基酚相当，量效关系良好。原因可能是,醋炙后山柰中的黄酮类和挥发油类成分与醋酸结合成更易溶出的可溶性醋酸盐，醋酸促进部分糖苷类成分水解成具有抗炎镇痛活性的苷元；对甲氧基肉桂酸乙酯易溶于乙醇等有机溶剂而难溶于水。本文结果进一步阐明了中药炮制理论的科学性与合理性,验证了对甲氧基桂皮酸乙酯是山柰抗炎镇痛的主要药效物质基础,为后续山柰的炮制和提取工艺优化研究奠定了基础。

本文比较了流动相为甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.3%磷酸水、甲醇-0.5%磷酸水,有机相与水相体积比(80∶20,60∶40,52∶48,30∶70),柱温分别为25、30、35 ℃时的色谱图。结果表明,流动相为乙腈-水、甲醇-0.5%磷酸水时,色谱基线较稳定,峰的分离度大,峰形良好；有机相与水相体积比为60∶40时,对甲氧基肉桂酸乙酯的保留时间适中,在3个柱温条件下对甲氧基肉桂酸乙酯的出峰情况无明显差异。综合实际情况考虑,以流动相为甲醇-质量分数0.5%(pH=2.3)磷酸水溶液(体积比60∶40),检测波长为280 nm,柱温为25 ℃作为液相色谱条件。本文建立了对甲氧基肉桂酸乙酯的测定方法,经方法学验证精密度、重现性、稳定性良好(RSD<2%)。该方法定量准确、专属性强、回收率高,适用于山柰中对甲氧基肉桂酸乙酯的含量测定[17]。

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(责任编辑：陈翔)

Study on the effects of anti-inflammatory and analgesic and the determination of EPMC from Kaempferia Rhizoma before and after vinegar processing

WU Yanting,CHEN Guitian,SHI Jun,GUO Jiajun

(SchoolofTraditionalChineseMedichine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To compare the effect of different processing technique on analgesic and anti-inflammatory inKaempferiaRhizoma,and to establish a method for the determination of Ethylp-methoxy cinnamate (EPMC). Methods The HPLC method was used for the determination of EPMC. Xylene induced ear swelling and hot plate test were adopted to observe anti-inflammatory and analgesic effects. Results The content of EPMC in different processed products ofKaempferiaRhizomawas as follows: the alcohol extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizoma>the alcohol extracts from cleansingKaempferiaRhizoma>the water extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizoma>the water extracts from cleansingKaempferiaRhizoma. All the four extracts ofKaempferiaRhizomahad obvious analgesic and anti-inflammatory effects compared to NS group (P<0.05 orP<0.01),but the alcohol extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizomawere better than the water extracts from cleansingKaempferiaRhizoma(P<0.05). Conclusion The higher content of EPMC and stronger analgesic and anti-inflammatory effects were observed in the vinegar-processedKaempferiaRhizoma. EPMC might be the effective part on analgesic and anti-inflammatory.

KaempferiaRhizoma; vinegar processing technology; analgesia and anti-inflammatory; HPLC

2016-08-05

广东药科大学创新强校项目(广东省高校优秀青年教师培养计划资助类别，2015cxqx209)

吴艳婷(1993—),女,2016级中药学硕士研究生,Email：13437871411@sina.cn；通信作者：时军(1980—),男,副教授,主要从事中药新药及制剂新技术研究,电话：020-39352169,Email：shijun8008@163.com。

时间：2016-11-24 16:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161124.1600.001.html

R283.3

A

1006-8783(2016)06-0679-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016080503