右归丸对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴的动态影响

陈李圳，王秀凤，马娜，廖成彬，刘基，赖炳荣，黄沐阳，陈树龙

(1.广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006； 2.广东药科大学 基础学院，广东 广州 510006； 3.中国中医科学院 针灸研究所，北京 100700)



右归丸对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴的动态影响

陈李圳1，3，王秀凤2，马娜2，廖成彬2，刘基1，赖炳荣1，黄沐阳1，陈树龙1

(1.广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006； 2.广东药科大学 基础学院，广东 广州 510006； 3.中国中医科学院 针灸研究所，北京 100700)

目的 动态研究右归丸对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响。方法 90只SD大鼠随机分成3组：正常组、模型组和右归丸组。采用氢化可的松构建肾阳虚模型，造模第8天开始，药物组用右归丸汤剂灌胃，正常组和模型组用生理盐水灌胃。分别在第15、23、30天处死动物，检测血清中促甲状腺素(TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)和四碘甲腺原氨酸(T4)的含量，检测下丘脑匀浆中促甲状腺激素释放激素(TRH)的含量，并对垂体、甲状腺质量进行称重和组织切片HE染色观察。结果 与正常组比较，肾阳虚模型组大鼠各期TRH、TSH、T3、T4的含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，右归丸组各期下丘脑-垂体-甲状腺轴激素水平均有升高，其中垂体-甲状腺轴激素水平升高明显(P<0.01),右归丸对垂体-甲状腺轴TSH、T3、T4的动态调整程度不一。结论 在肾阳虚证动态发展过程中，下丘脑-垂体-甲状腺轴激素水平变化明显且TSH、T3、T4是敏感指标。

右归丸； 肾阳虚； 下丘脑-垂体-甲状腺轴； 动态影响

肾阳虚证是中医临床上常见证候，主要表现为腰膝酸软、畏寒肢冷、小便清长，男子阳痿早泄，女子宫寒不孕。中医证是动态发展变化的，肾阳虚证也是动态变化的，有关肾阳虚证的动态研究在中西医结合方面少有报道，前期课题组为深入认识肾阳虚本质，建立了肾阳虚证大鼠的动态模型，观察大鼠垂体-甲状腺轴的动态变化并初步分析了右归丸对肾阳虚大鼠垂体-甲状腺轴动态影响[1-3]。下丘脑是神经-内分泌网络的调节中枢，本实验在前期研究的基础上，将垂体-甲状腺轴扩大为下丘脑-垂体-甲状腺轴，进一步研究右归丸对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴的动态影响。

1 材料

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，SPF级，体质量180～220 g，广东省实验动物中心提供，生产许可证号: SCXK(粤)2012-0125。

1.2 药物与试剂

中药复方右归丸的各味药材购自广州采芝林药店，经广东药科大学中药学院中药资源系马鸿雁副教授鉴定为正品；0.9%NaCl注射液(贵州天地药业有限公司)；氢化可的松注射液(天津金耀药业有限公司)；无水乙醇(天津市百世化工有限公司)；TRH、TSH、T3和T4试剂盒(北京华英生物技术研究所)。

2 方法

2.1 肾阳虚模型的构建[4]

取SD雄性大鼠90只,随机分为正常组、模型组和右归丸组，每组各30只。正常组:后肢肌内注射0.9%NaCl溶液0.3 mL，1次/天，自由饮水饮食，连续29 d；模型组：将氢化可的松注射液充分混匀，后肢肌肉注射2.5 mg/100 g，每天1次，连续29 d，自由饮水饮食，复制肾阳虚大鼠动物模型；右归丸组:氢化可的松注射方法和用量同模型组，第8天开始用右归丸煎液灌胃，连续22 d，自由饮水饮食，正常对照组和模型组以生理盐水灌胃。

2.2 体质量、组织称重及组织切片HE染色观察

各组大鼠第15、23、30天后称质量；各期大鼠处死后取垂体、甲状腺称质量并进行组织切片HE染色观察。

2.3 激素指标的测定

为了动态观察，分别于第15、23、30天处死正常组、模型组和右归丸组大鼠各10只，股动脉取血并分离血清，断头取下丘脑并匀浆，用放射免疫分析法分别测定匀浆样品中TRH和血清样品中TSH 、T3、T4的含量，按照放免试剂盒操作说明书操作。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 各组一般情况比较

模型组和右归丸组不同时期动物出现不同程度的体质量减轻、活动迟钝、喜扎堆、畏寒喜暖、体毛枯萎、饮食饮水减少等。模型组第15、23、30天症状逐步加重，采食量和饮水量增加，相比之下右归丸组大鼠毛发有光泽，活动增加，反应较灵敏，但总体活动能力与正常组比较仍有差距。

3.2 各组大鼠垂体、甲状腺质量的动态变化

随着造模时间的延长，模型组和右归丸组SD大鼠甲状腺质量明显减轻，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01)，垂体质量和其他组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠垂体、甲状腺质量的动态变化

组别垂体质量/mg甲状腺质量/mg正常组第15天0.011±0.00140.254±0.0179第23天0.011±0.00030.258±0.0179第30天0.011±0.00130.265±0.0251模型组第15天0.010±0.00110.204±0.0197*第23天0.012±0.00100.217±0.0231*第30天0.010±0.00040.213±0.0247*右归丸组第15天0.009±0.00180.206±0.0195*▲第23天0.013±0.00160.215±0.0238*第30天0.011±0.00140.208±0.0204*

与正常组比较：*P<0.01； 与模型组第23天比较：▲P<0.01。

3.3 组织形态学结果

3组第15、23天垂体及甲状腺的组织形态学变化不明显，第30天可以看出某些变化趋势，见图1、图2。相比于正常组的垂体，模型组垂体组织嗜酸性细胞增多，嗜碱性细胞减少，并有空泡变性；右归丸组垂体组织细胞界限还不是很清晰，但已接近正常组，嗜酸性细胞有所增多，嗜碱性细胞相对模型组有所减少(图1)。模型组甲状腺组织中甲状腺数量减少，且滤泡变得不清晰，充满胶质，且数量也有所减少，滤泡大小不等；右归丸组甲状腺细胞数量有所增加，滤泡结构正常，界限较为整齐，与正常组较为接近(图2)。

A.正常组； B.模型组； C.右归丸组。

图1 第30天各组垂体组织形态学观察(100×)

Figure 1 Histomorphology of rat pituitary gland on day 30 (100×)

A.正常组； B. 模型组； C. 右归丸组。

图2 第30天各组甲状腺组织形态学观察(100×)

Figure 2 Histomorphology of rat thyroid gland on day 30 (100×)

提示肾阳虚导致大鼠垂体和甲状腺细胞结构发生变化，右归丸治疗肾阳虚后其垂体和甲状腺细胞结构得到了很大改善，但还不能完全达到正常水平。

3.4 激素指标测定结果

3.4.1 肾阳虚造模情况分析 与正常组比较，模型组SD大鼠各期TRH 、TSH、T3、T4水平均明显下降(P<0.01)，说明肾阳虚证造模成功；与模型组第23天比较，模型组第30天TSH、T3、T4水平比较均明显下降(P<0.01)，而TRH水平无明显下降，见表3，说明肾阳虚在发展过程中垂体-甲状腺轴的功能逐步减退而下丘脑功能则变化不明显。

3.4.2 右归丸对下丘脑-垂体-甲状腺轴功能调节的动态分析 与模型组各时期比较，右归丸组第15、23、30天TSH、T3、T4水平升高明显，差异有统计学意义(P<0.01)。与垂体结构和甲状腺结构恢复的程度较为一致,说明右归丸对肾阳虚SD大鼠垂体-甲状腺轴的功能有显著的调整作用，而TRH差异没有统计学意义，表明右归丸对下丘脑部位调节不明显。见表2。

表2 第15、23、30天SD大鼠血清下丘脑-垂体-甲状腺轴激素TRH、TSH、T3、T4水平的动态变化

与正常组比较：*P<0.01； 与模型组第15天比较：△P<0.01； 与模型组第23天比较：▲P<0.01； 与模型组第30天比较：□P<0.01； 与右归丸组第15天比较：■P<0.01； 与右归丸组第23天比较：○P<0.01。

4 讨论

本实验模型组大鼠各期下丘脑-垂体-甲状腺轴激素指标值具有显著性变化，表明肾阳虚大鼠模型构建成功。右归丸组SD大鼠各期下丘脑-垂体-甲状腺轴激素指标值的不一致性波动，提示右归丸调节肾阳虚证是一个相对缓慢的动态过程。

由于应激的调控中心位于中枢神经系统，当机体受到各种强烈因素刺激时，可激活神经内分泌系统[5]。越来越多的证据表明[6-8]，下丘脑-垂体-甲状腺轴为急性应激反应的神经内分泌系统。近来发现重复的应激刺激可减少甲状腺激素的分泌，但下丘脑TRH的分泌未见改变[9]。这或许可以部分解释本实验后期出现的TRH与TSH、T3、T4波动幅度不一致、下丘脑 TRH 的分泌没有显著性改变的现象，本实验后期是采用边造模边给药的方式，人为的重复刺激使反馈抑制作用增强，造成了下丘脑TRH的分泌未见明显改变。

本研究结果显示，模型组大鼠甲状腺质量变化明显，而垂体质量变化不明显，提示靶腺层先受到影响，垂体层所受影响变化不明显抑或延迟；同时从甲状腺和垂体晚期才出现较明显的形态学变化提示形态学变化相比血清激素不敏感或延迟。

综上研究，在肾阳虚证动态发展过程中，下丘脑-垂体-甲状腺轴激素水平变化明显，TSH、T3、T4为敏感指标。右归丸可以有效地调节肾阳虚，但下丘脑部位激素的作用机制尚不明确，有待于进一步深入研究。

[1] 王建红,伍庆华,刘海云,等.肾阳虚大鼠垂体-甲状腺轴功能动态分析[J].辽宁中医杂志,2006,33(6):751-752.

[2] 马娜,罗来成,朱东海.右归丸对肾阳虚大鼠垂体-甲状腺轴动态影响的实验研究[J].中国现代药物应用,2014,8(13):246-247.

[3] 张磊,廖成彬,黄榕波,等.右归丸调节肾阳虚垂体-靶腺轴功能的动态变化[J].广东药学院学报,2016,32(1):102-106.

[4] 马娜,王建红,闵建新,等.肾阳虚大鼠垂体-靶腺轴功能动态变化的研究[J].时珍国医国药,2009,20(9): 2123-2125．

[5] 朱建华.探讨甲状腺疾病患者血清中T3,T4,TSH检测的临床应用[J].中国医学检验杂志,2006,7(6):406-408.

[6] 周晓莉,饶一武.应激状态下患者下丘脑—垂体—肾上腺轴功能的变化[J]. 医学综述,2014,20(13):2439-2440.

[7] HELMREICH D L,TYLEE D.Thyroid hormone regulation by stress and behavioral differences in adult male rats[J]. Horm Behav,2011,60(3):284-291.

[8] BELLO G,CEAICHISCIUC I,SILVA S,et al. The role of thyroid dysfunction in the critically ill: a review of the literature[J]. Minerva Anest,2010,76(11):919-928.

[9] HELMREICH D L,PARFITT D B,LU X Y,et al. Relation between the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis and the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis during repeated stress [J]. Neuroendocrinology,2005,81(4):183-192.

(责任编辑：幸建华)

Dynamic influence of Yougui pill on hypothalamic-pituitary-thyroid axis in kidney-yang deficiency rats

CHEN Lizhen1,3,WANG Xiufeng2,MA Na2,LIAO Chengbin2,LIU Ji1,LAI Bingrong1,HUANG Muyang1,CHEN Shulong1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.BasicSchoolofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 3.InstituteofAcupunctureandMoxibustion,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective To study the dynamic influence of Yougui pill (YP) on hypothalamic-pituitary-thyroid axis in kidney-yang deficiency rats. Methods 90 SD rats were randomly divided into three groups,including the normal group,the model group and YP group. The model of rat kidney-yang deficiency was established by intramuscular injection of hydrocortisone. Rats in the YP group were administrated intragastrically with YP after 8 days,and rats in the normal and model groups were given normal saline. Animals in all groups were sacrificed on 15,23 and 30 days,the levels of TRH,TSH,T3and T4were measured and the pituitary and thyroid glands were removed,weighed and sectioned for H&E staining. Results Compared with the normal group,the levels of TRH,TSH,T3and T4were decreased significantly in the model group (P<0.01). The hormone levels of hypothalamus-ituitary-hyroid axis were increased in model rats when treated with YP,in which the pituitary-thyroid hormone levels were enhanced significantly (P<0.01) with the dynamic difference. Conclusion During dynamic development of kidney-yang deficiency syndrome,the hormone levels of hypothalamus-pituitary-thyroid axis obviously changes and TSH,T3and T4are sensitive indicators.

Yougui pill; kidney-yang deficiency; hypothalamic-pituitary-thyroid axis; dynamic effects

2016-07-12

国家自然科学基金项目(81403153)

陈李圳(1992—)，男，2016级硕士研究生，主要从事中西医结合针灸与药物机制研究，Email：964328383@qq.com；通信作者：王秀凤(1980—)，女，副教授，硕士生导师，主要从事生物系统与数据挖掘研究，Email：wxfsnow8012@126.com。

时间：2016-11-29 11:15

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1115.009.html

R285.5

A

1006-8783(2016)06-0771-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016071201