局部晚期宫颈癌细胞中乏氧诱导因子-1α表达及其与预后的关系

谢福川,邵汛帆,白力

(1. 广州医科大学附属肿瘤医院 放疗科,广东 广州 510095; 2.广东惠州中心人民医院 肿瘤放射治疗中心,广东 惠州 516001)



局部晚期宫颈癌细胞中乏氧诱导因子-1α表达及其与预后的关系

谢福川1,2,邵汛帆1,白力2

(1. 广州医科大学附属肿瘤医院 放疗科,广东 广州 510095; 2.广东惠州中心人民医院 肿瘤放射治疗中心,广东 惠州 516001)

目的 观察宫颈鳞癌细胞中乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达情况及其与预后的关系。方法 通过治疗前检测119 例宫颈鳞癌患者HIF-1α的表达情况,并分析阳性、阴性表达组放化疗疗效并研究其与宫颈癌预后的关系。结果 119例中晚期宫颈鳞癌患者中HIF-1α表达阳性者86 例(72.3%)，表达阴性者33 例(27.7%)。Ⅱ、Ⅲ期患者表达阴性者的有效率(94.7%、85.7%) 高于表达阳性者(87.8%、75.6%)，差异有统计学意义(P=0.032,P=0.041)；表达阴性者(89.4%、78.5%)2 年局控率高于表达阳性者(75.5%、70.2%)，差异有统计学意义(P=0.021、P=0.035)；表达阴性者2年生存率(100%、85.7%)高于表达阳性患者(91.2%、72.9%)，差异有统计学意义(P=0.034、P=0.041)。结论 大部分中晚期宫颈鳞癌细胞HIF-1α表达阳性，对于Ⅱ、Ⅲ期患者HIF-1α表达阳性与不良预后相关。

乏氧诱导因子-1α; 宫颈癌细胞; 表达; 预后

宫颈癌是严重威胁女性健康的一种恶性肿瘤，发病率占我国妇女生殖系统恶性肿瘤的首位[1]。宫颈癌根据组织学可分为鳞状细胞癌、腺癌、混合癌等，其中鳞状细胞癌占绝大多数。早期宫颈癌多无明显症状，大多数宫颈癌出现阴道流血等症状进行诊治时已处于中晚期状态。目前临床上治疗宫颈癌的主要方式为手术治疗及同步放化疗，早期宫颈癌治疗以单纯手术或单纯放疗为主，二者疗效均良好，有效率相当，5年生存率超过90%。局部晚期宫颈癌患者因存在肿瘤体积大、淋巴结扩散、分化程度低等转移和复发的高危因素，若单纯进行放疗或手术治疗无法取得较好的疗效，患者整体生存率不高。同期放化疗是局部晚期宫颈癌的根治性治疗手段，可有效降低宫颈癌的局部复发及远处转移率[2]。大多数人类实体肿瘤微环境中存在缺氧状态，缺氧能诱发局部新血管生成、肿瘤扩增和复发，对治疗效果造成较大影响[3]。已有研究发现缺氧状态下激活的核转录因子：乏氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha)是维持机体氧稳态，调节组织或细胞适应乏氧、介导细胞存活的重要调控因子，几乎调控了缺氧所诱导的所有基因的转录。肿瘤的进展及对放化疗的抗拒和不良预后与乏氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的过度表达有关[4]。检测肿瘤细胞中HIF-1α的表达情况，能够较好地评估肿瘤细胞的乏氧程度，进一步了解HIF-1α与肿瘤预后的关系。本文分析本中心2012年1月至 2013年10月119例局部晚期宫颈癌患者治疗前所检测的HIF-1α表达情况，探讨其与宫颈癌疗效及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集惠州中心人民医院肿瘤放射治疗中心2012 年1月至2013年10月119例中晚期宫颈癌患者。均采用FIGO(2009年)临床分期，根据HIF-1α表达情况分为阳性表达组及阴性表达组。符合以下条件：①均经病理组织学确诊为宫颈鳞状细胞癌。②临床分期Ⅱ～Ⅲ期，均未进行过放化疗，既往无恶性肿瘤病史。③年龄<70岁。④KPS评分≥70分。治疗前所有患者血常规、肝、肾功能均正常，无远处器官转移情况。病例总数119例，其中Ⅱ期68例，Ⅲ期51例。年龄29～69岁之间，中位年龄49岁。

1.2 治疗方法

119例宫颈鳞癌患者均采用同期放化疗。

根治性放疗：先采用6MV-X 线盆腔二维外照射，前后对穿大野照射DT 30 Gy(每周5 次，每次2 Gy，连续3周，共15次)，后改四野照射DT 20 Gy(每周5 次，每次2 Gy，连续2周，共10 次；射野界限不变，仅在全盆腔照射野中央挡3～4 cm 宽铅块)。当盆腔大野照射20 Gy 后即开始同期采用192 Ir 后装机行腔内放疗，A 点剂量每次6 Gy，每周1 次，总剂量DT 36～42 Gy，共照射6～7 次，腔内照射当天不进行体外照射。

同期化疗：在放疗开始后，每周给予单药顺铂40 mg/m2同期化疗，每周1 次，连用6 次。

1.3 实验方法及主要试剂

兔抗人HIF-1α单克隆抗体、DAB显色剂以及SABC工作液试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。染色方法参照其说明进行。染色20min后，免疫组化步骤按照二步法说明书进行实验操作。病理切片常规进行脱蜡、水化，使用柠檬酸高压抗原修复，采用DAB溶液显色，苏木素进行复染。

1.4 结果判断

1.4.1 镜下观察 以磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为一抗阴性对照，预试验阳性片作为阳性对照。HIF-1α阳性表达主要定位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状着色，以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞即HIF-1α表达阳性。随机选取400倍显微镜下5个不同视野，各计数100个癌细胞，共计500个细胞，按阳性细胞数>50%强阳性(+++)，26%～50%阳性(++)，11%～25% 弱阳性(+)和< 10%为阴性(-)，每个视野中宫颈癌细胞同时进行评分，强阳性(+++) 为9～12分，中度阳性(++)为5～8 分，弱阳性(+) 为 1～4 分，阴性(-) 为0分，得分=5个视野评分总和的平均数，得分<5分病例纳入HIF-1α阴性组，得分≥5分病例纳入HIF-1α阳性组[5]。

1.4.2 疗效评定指标 治疗结束后4周进行评价，分别评价近期疗效和远期疗效。对比治疗前后妇科检查及盆腔CT、MRI、PET/CT 等检查的改变，按照WHO实体瘤疗效标准评定。完全缓解(CR)：病灶消失，且病灶的消失时间大于4 周；部分缓解(PR)：病灶(双径可测)2个最大直径的乘积减少程度大于50%以上，且持续时间大于4 周；病变进展(PD)：产生新的病灶，病灶(单径可测) 增大程度大于25% 或病灶(双径可测)2个最大直径的乘积增大大于25%；病变稳定(SD)：介于部分缓解和疾病进展之间[6-7]。

1.5 观察评价

1.5.1 近期疗效 两组病人治疗结束后按照实体瘤疗效评价，CR+PR评定为有效，其中近期治疗的总有效率=[CR+PR]/总例数。

1.5.2 远期疗效 2年局部控制率(CR+PR+SD)及生存率：生存时间从第 1 次放疗开始计算至末次随访或死亡为止，以月为计量单位。

1.6 统计学处理

统计分析采用 SPSS19.0 软件分析，疗效比较采用χ2检验，生存率的比较采用 log-rank 法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α表达情况

免疫组化技术检测显示，宫颈鳞状细胞癌组织细胞中的HIF-1α的阳性染色主要分布于癌细胞胞核内(见图1)。全部患119例，表达阳性者86 例(72.3%)，Ⅱ期49例、Ⅲ期37例。表达阴性者33例(27.7%)，Ⅱ期19 例、Ⅲ期14例。

2.2 近期疗效

治疗结束 4周后评价患者近期疗效。在Ⅱ 期、 Ⅲ 期患者中,表达阴者的有效率(94. 7%、 85.7%)高于表达阳性者(87.8%、 75.6%),差异有统计学意义(P=0.032,P=0.041) 。见表1。

2.3 远期疗效

Ⅱ期、Ⅲ患者中，表达阴性组2年局控率(89.4%、78.5%) 高于表达阳性者(75.5%、70.2%)，差异有统计学意义(P=0.027、P=0.029)；表达阴性组2年生存率(100%、85.7%) 高于表达阳性者(91.2%、72.9%),差异有统计学意义(P=0.034、P=0.041) 。见表2。

A.阳性表达; B.阴性表达。

图1 宫颈鳞癌细胞HIF-1α的表达情况(免疫组化,400×)

Figure 1 Expression of HIF-1α in cervical cancer squamous cells (immunohistochemistry,400×)

表1 HIF-1α 表达阴性、阳性患者放化疗后的有效率n(%)

Table 1 Effective rate in HIF-1α negative and positive expression groups

nⅡ期Ⅲ期HIF-1α表达阴性3318/19(94.7)12/14(85.7)HIF-1α表达阳性8643/49(87.8)28/37(75.6)χ24.4713.379P0.0410.032

表2 治疗后2年局部控制率及生存率

Table 2 Local control and survival rates after 2 years of treatment in HIF-1α negative and positive expression groups

n(%)

3 讨论

每年全世界大概有50万新发宫颈癌患者，占新发癌症的5%，其中大多数的新发病例产生在发展中国家，每年约有20多万女性死于宫颈癌，我国每年约有新发病例13万，占世界子宫颈癌新发病例总数的28%，宫颈癌好发年龄在35～39岁和60～64岁这两个时间段，平均发病年龄为52.2岁，研究显示其发病率在这些地区有上升趋势，患者逐渐年轻化[8-9]。乏氧是肿瘤细胞微环境的特征之一，会刺激肿瘤细胞分泌多种促血管生成因子等，以促进血管的生成，改善肿瘤供血及营养供给，增强肿瘤细胞放射性、化学性损伤的修复。因此，乏氧状态会增加肿瘤对放化疗的抗拒性，降低放化疗效果。

肿瘤乏氧在实体肿瘤中是一个常见的现象，实体肿瘤的氧分压(PaO2)低于肿瘤起源的正常组织，是随着瘤体增大和血供不充足所形成的重要生存微环境。为了适应乏氧，增加氧的利用和减少氧的消耗,快速分裂的肿瘤细胞许多基因的转录活性发生改变，相关研究发现乏氧在肿瘤的进展、远处转移，乃至肿瘤对放疗、化疗和光动力学治疗抵抗等方面都起着极其重要的作用。临床上存在部分患者接受放化疗后疗效不佳，主要原因与肿瘤细胞内存在乏氧细胞有关，乏氧细胞约占实体肿瘤总细胞数的10%～50%，其对放化疗有抗拒性，无氧酵解供能能够维持低氧细胞的存活功能，乏氧状态得到改善后，即可分裂、增殖，成为以后肿瘤复发、转移的根源。多项研究证明HIF-1α会降低恶性肿瘤的放射敏感性，HIF-1α通过抑制细胞凋亡及调控DNA 修复过程的因子表达，使电离辐射对肿瘤细胞DNA 的损伤无法固定；同时HIF-1α促进血管生成、无氧代谢，使逃离电离辐射物理杀伤的肿瘤细胞获得必要的生存条件，最终降低放疗敏感性[10]。HIF-1α参与肿瘤新生血管形成及转移机制，在肿瘤的发展及侵袭转移等方面发挥重要的作用[11]。梁少强等报道HIF-1α的表达分别与宫颈癌临床分期、放疗敏感性和骨、肺、肝等远处转移和5 年生存期有关[12]。

本研究显示，HIF-1α在中晚期宫颈癌细胞中呈现高表达，119例中晚期宫颈癌细胞中的HIF-1α染色主要位于细胞核中，表达阳性者86 例(72.3%)，表达阴性者33 例(27.7%)。Ⅱ、Ⅲ期患者表达阴性者的治疗有效率高于表达阳性者，差异有统计学意义。该结果可能与中晚期宫颈癌细胞中HIF-1α过表达，调节肿瘤细胞适应低氧的微环境的改变并促进新生血管生成，导致相关基因的转录增强有关，提示HIF-1α的高表达与宫颈癌疗效有密切相关。另外，在局部晚期宫颈鳞状细胞癌中HIF-1α阳性表达的患者治疗后2年局控率及生存率较差，提示 HIF-1α阳性表达与宫颈癌患者的不良预后相关，HIF-1α阳性表达对判断宫颈癌治疗疗效、复发及远处转移有参考意义，有助于进一步了解宫颈癌生物学行为，为临床诊治提供新的方向。未来通过使用针对性的靶向药物沉默HIF-1α的表达来抑制肿瘤血管生长、降低肿瘤细胞能量供给、减少肿瘤细胞放化疗损伤的修复，可能有助于提高宫颈癌患者治疗效果。本研究初步分析了 HIF-1α对局部晚期宫颈鳞癌预后的影响作用，更长时间的生存观察及确切的结果还需进一步的研究。

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(责任编辑：王昌栋)

Relationship between the expression of HIF-1α in locally advanced cervical cancer cells and this disease prognosis

XIE Fuchuan1,2,SHAO Xunfan1,BAI Li2

(1.DepartmentofCancerRadiotherapy,CancerCenterofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510095,China; 2.DepartmentofCancerRadiotherapyCentralofHuizhouMunicipalCenterHospital,Huizhou516001,China)

Objective To explore the relationship between the expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1α) in locally advanced cervical cancer cells and this disease prognosis. Methods A total of 119 patients with stage II-III cervical squamous cancer treated with concurrent chemo-radiotherapy were enrolled in this study. The expression of HIF-1α was detected by immunohistochemistry. The correlation between HIF-1α expression and disease prognosis was analyzed. Results The number of HIF-1α positive expression was 86 cases (72.3%),and the number of HIF-1α negative expression was 33 cases (27.7%). For stage Ⅱ and Ⅲ patients,the effective rate in HIF-1α negative and positive expression groups after treatment was (94.7%,85.7%) and (87.8%,75.6%),respectively. The difference was statistically significant (P=0.032,P=0.041). The local control rate after 2 years of treatment in HIF-1α positive group was significantly higher than that in the HIF-1α negative expression group (89.4%,78.5%vs75.5%,70.2%,P=0.021,P=0.035). The survival rate after 2 years of treatment in HIF-1α negative expression group was significantly higher than that in the HIF-1α positive expression group (100%,85.7%vs91.2%,72.9%,P=0.034,P=0.041). Conclusion HIF-1α is positively expressed in most of cervical squamous cancer cells,which is correlated with poor prognosis in stage Ⅱ and Ⅲ patients.

HIF-1 alpha; advanced cervical squamous cancer cells; expression; prognosis

2016-02-19

谢福川，男，硕士研究生，主治医师，主要从事肿瘤放射治疗研究,Email:95858301@qq.com;通信作者:邵汛帆(1963—),男,主任医师,主要从事肿瘤放射治疗,Email:xunfanshao@ hotmail.com。

时间：2016-11-25 14:18

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161125.1418.002.html

R737.33

A

1006-8783(2016)06-0801-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016021902