COPD患者Th17细胞和Treg细胞介导的免疫应答变化及免疫失衡与肺功能的关系研究

门 翔 尚喜雨

(河南省南阳市中心医院呼吸内科一病区,南阳473000)

COPD患者Th17细胞和Treg细胞介导的免疫应答变化及免疫失衡与肺功能的关系研究

门 翔 尚喜雨①

(河南省南阳市中心医院呼吸内科一病区,南阳473000)

目的：探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血Th17细胞和调节性T细胞(Treg)及其介导的免疫应答变化与患者肺功能的关系。方法：选取本院呼吸内科收治的90例COPD患者(COPD组)和同期年龄、性别基本匹配的45例健康体检对象作为对照组，并根据COPD病情进行亚组分析，分别测定各组研究对象肺功能指标、Th17细胞、Treg细胞及血清炎症因子水平。结果：在COPD患者间，随着病情加重，FEV1%、FVC%、FEV1/FVC比值中度COPD组<重度COPD组<极重度组(P<0.05)；在COPD患者间，随着病情加重，外周血中Th17细胞、Th17/Treg比值中度COPD组<重度COPD组<极重度组(P<0.05)，外周血Treg细胞比值中度COPD组>重度COPD组>极重度组(P<0.05)，且外周血Th17细胞、Treg细胞相关细胞因子变化具有一致性；COPD患者的肺功能指标FEV1%、FVC%、FEV1/FVC与外周血中Th17细胞、Th17/Treg比值呈显著的负相关关系(P<0.05)，肺功能指标FEV1%、FVC%、FEV1/FVC与外周血Treg比值呈显著的正相关关系(P<0.05)。结论：COPD外周血Th17/Treg比值与患者肺功能下降具有显著的相关性。

慢性阻塞性肺疾病；Th17细胞；调节性T细胞；免疫应答；肺功能

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmo-nary disease,COPD)是临床常见的一种慢性气道炎症性疾病，其临床特征为不可逆的气流受限，主要表现为反复咳嗽、咳痰、气促、进行性肺功能下降。有研究发现，COPD的发生和进展与易感性体重、环境污染、刺激性烟雾吸入等诸多因素相关，近年来随着环境的恶化，COPD的发病率逐年递增[1]。免疫学研究结果发现，COPD患者机体存在免疫功能紊乱，大量细胞因子、趋化因子破坏患者的自身免疫耐受，刺激免疫效应细胞，近年来的大量研究表明，T细胞介导的自身免疫应答在COPD的病程进展中发挥着重要的作用[2]。

活化的CD4可分化为多种功能不同的效应性T细胞，包括Th1、Th2、Th7、Treg细胞等。 其中Th17通过分泌炎性细胞因子介导自身免疫应答，Treg细胞通过分泌抑炎性细胞因子抑制自身免疫应答，使机体达到免疫耐受。Th17与Treg之间的平衡在保持免疫耐受、抑制自身免疫应答中具有重要意义[3]。本研究探讨了COPD患者外周血Th17细胞和Treg及其介导的免疫应答变化与患者肺功能的关系，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 纳入标准 (1)COPD患者的诊断及病情分级依据中华医学会呼吸病学分会、慢性阻塞性肺疾病全球防治策略(GOLD)中的标准；(2)所有COPD患者均在本院呼吸内科经过治疗后处于稳定期的患者；(3)自愿接受本次研究并签定知情同意书。

1.1.2 排除标准 (1)合并呼吸系统其他疾病(肺结核、支气管扩张、肺脓肿、肺癌等)；(2)伴有心力衰竭的患者；(3)伴有免疫系统疾病、类风湿性疾病、全身感染性疾病的患者；(4)合并精神性疾病、认知功能障碍的患者。

1.1.3 研究对象 选取本院呼吸内科收治的90例COPD患者(COPD组)和同期年龄、性别基本匹配的45例健康体检者(对照组)为研究对象。

COPD组90例患者，男54例、女36例，年龄范围57～78岁，平均年龄(65.5±7.1)岁，体质量指数(BMI)(23.3±2.6) kg/m2，吸烟32例，合并疾病：高血压31例、糖尿病19例，其他12例；GOLD疾病分级：中度33例、重度34例、极重度23例。对照组45例患者，男28例、女17例，年龄范围54～75岁，平均年龄(66.1±6.9)岁，BMI(23.1±2.4)kg/m2，吸烟15例。两组研究对象的年龄、性别及吸烟构成无统计学意义(P>0.05)。

1.1.4 实验仪器与药品 流式细胞仪，型号EPICS，美国贝克曼库尔特公司。荧光定量PCR仪，型号ABI 7500，美国Applied Biosystems公司。酶标仪，型号680，美国Bio Rad公司。低温高速离心机，型号D-37520，德国Lengend RT公司。肺功能测定仪，型号chest-25F，日本捷斯特公司。本研究中所有试剂盒均购自上海源叶生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 研究指标 检测并对象比各组研究对象的肺功能指标：第一秒用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1%)、用力肺活量占预计值的百分比(FVC%)、FEV1/FVC；检测并比较各组研究对象外周血中Th17细胞、Treg细胞所占比值；检测各组研究对象的外周血细胞因子：白细胞介素-17A(IL-17A)、IL-1β、IL-6、IL-10的差异。

1.2.2 指标检测方法 肺功能测定时间安排在上午，使用沙丁胺醇200 μg，等待15 min后开始测定肺功能参数。

抽取空腹静脉血2 ml，分离外周血单个核细胞，调节浓度为2×106个/ml，铺至24孔板。在1640培养液中加入10%胎牛血清。每孔加入PMA 2.5 μl和离子霉素2 μl，混匀后放入37℃二氧化碳孵箱中刺激培养。进行刺激培养4 h，每孔加入BFA 2 μl阻断2 h后收集细胞，分别加入FITC标记的CD3抗体和PE-Cy5标记的CD8抗体，避光孵育 30 min，PBS缓冲液洗涤后加入固定破膜试剂盒中的试剂A固定，室温避光孵育15 min。PBS缓冲液洗涤后加入试剂B，加入PE标记的IL-17a单克隆抗体，避光孵育30 min。PBS缓冲液洗涤后以500 μl PBS缓冲液重悬细胞，上机分析检测Th17细胞。PBMC加入FITC标记的CD4单克隆抗体和PE-Cy5标记的CD25单克隆抗体，胞内标记PE标记Foxp3抗体，根据操作说明书检测Treg细胞。

血清细胞因子IL-17A、IL-1β、IL-6、IL-10检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，按照试剂盒操作步骤。

2 结果

2.1 各组研究对象的肺功能测定 中度、重度和极重度COPD组患者的FEV1%、FVC%、FEV1/FVC比值均显著低于对照组(P<0.05)，在COPD患者间，随着病情加重，FEV1%、FVC%、FEV1/FVC比值中度COPD组<重度COPD组<极重度组(P<0.05)；见表1。

2.2 各组研究对象的外周血Th17、Treg细胞测定 中度、重度和极重度COPD组患者的外周血中Th17细胞、Th17/Treg比值均显著高于对照组(P<0.05)、外周血Treg细胞比值显著低于对照组(P<0.05)；在COPD患者间，随着病情加重，外周血中Th17细胞、Th17/Treg比值中度COPD组<重度COPD组<极重度组(P<0.05)，外周血Treg细胞比值中度COPD组>重度COPD组>极重度组(P<0.05)；见表2。

2.3 各组研究对象的外周血细胞因子水平比较

GroupsnFEV1%FVC%FEV1/FVC(%)Controlgroup451042±781038±69830±62ModerateCOPDgroup33651±621)820±841)512±701)SevereCOPDgroup34398±561)2)794±811)2)401±591)2)Extremelyseveregroup23260±411)2)3)718±711)2)3)340±661)2)3)F470282219631047P<0001<0001<0001

Note：Compared with control group，1)P<0.05, with moderate COPD group,2)P<0.05, and severe COPD group，3)P<0.05.

GroupsnTh17cells(%)Tregcells(%)Th17/TregControlgroup45123±039337±084037±013ModerateCOPDgroup33252±0741)238±1291)106±0271)SevereCOPDgroup34619±1301)2)182±0551)2)357±0981)2)Extremelyseveregroup23683±1121)2)3)124±0261)2)3)551±1171)2)3)F10198251476171914P<0001<0001<0001

Note：Compared with control group，1)P<0.05, with moderate COPD group，2)P<0.05, and severe COPD group,3)P<0.05.

GroupsnIL⁃17A(pg/ml)IL⁃1β(pg/ml)IL⁃6(pg/ml)IL⁃10(pg/ml)Controlgroup452074±519339±0851586±21716938±1927ModerateCOPDgroup333609±7141)1391±2431)4981±5281)7980±12351)SevereCOPDgroup344785±9201)2)1685±3071)2)6338±7291)2)4116±9311)2)Extremelyseveregroup236033±13071)2)3)2385±4341)2)3)7945±8161)2)3)2985±6991)2)3)F39876831855128455903P<0001<0001<0001<0001

Note：Compared with control group,1)P<0.05, with moderate COPD group,2)P<0.05, and severe COPD group,3)P<0.05.

表4 COPD患者外周血Th17、Treg细胞与患者肺功能相关性

Tab.4 Correlation of peripheral blood Th17, Treg cells and pulmonary function in COPD patients

IndexFEV1%rPFVC%rPFEV1/FVC(%)rPTh17cells-0628<0001-0719<0001⁃0731<0001Tregcells0567<00010601<00010644<0001Th17/Treg-0694<0001-0793<0001-0821<0001

中度、重度和极重度COPD组患者的外周血IL-17A、IL-1β、IL-6均显著高于对照组(P<0.05)、外周血IL-10显著低于对照组(P<0.05)；在COPD患者间，随着病情加重，外周血中IL-17A、IL-1β、IL-6值中度COPD组<重度COPD组<极重度组(P<0.05)，外周血IL-10值中度COPD组>重度COPD组>极重度组(P<0.05)；见表3。

2.4 COPD患者外周血Th17、Treg细胞与患者肺功能相关性 COPD患者的肺功能指标FEV1%、FVC%、FEV1/FVC与外周血中Th17细胞、Th17/Treg比值呈显著负相关关系(P<0.05)，肺功能指标FEV1%、FVC%、FEV1/FVC与外周血Treg比值呈显著的正相关关系(P<0.05)；见表4。

3 讨论

COPD是一种由多种炎性细胞共同参与的气道高反应性慢性炎症，患者肺功能呈现进行性损伤，不仅累及呼吸系统，随着病程进展还可累及全身各重要器官和系统，引起全身炎症反应综合征、血管内皮功能紊乱、凝血机能异常等问题[4]，有研究证实，机体免疫功能紊乱，尤其是T淋巴细胞的分泌和表达失衡是导致COPD发生的重要作用机制[5]。Treg在COPD的病程进展中起着重要的免疫调节作用，正常情况下，Th细胞处于平衡状态，机体生理防御、自身稳定、免疫监视等免疫功能良好，一旦Th平衡被破坏，引起Th1/Th2失衡、Th17细胞过度表达，可引起COPD的发生[6]。因此研究COPD患者外周血Th17细胞和Treg及其介导的免疫应答变化对延缓病程进展、改善患者预后具有积极的意义[7]。

免疫学机制在COPD的发病和进展中的重要作用已得到临床公认，尤其是COPD患者自身抗原、自身免疫应答所介导的炎症反应的相关研究较多[8]。当外界刺激引起气道上皮损伤后，损伤的上皮细胞未完全被巨噬细胞所吞噬，进而出现抗原改变而成为一种自身抗原，引发机体自身免疫应答，导致或加重气道炎症损伤。巨噬细胞、中性粒细胞、CD8、CD4等免疫细胞均参与了这一过程[9]，有研究发现，初始T细胞的分化方向与周围微环境状态有关[10]。如周围环境中IL-6、IL-1β、TGF-β等炎症性细胞因子浓度高时，初始T细胞向Th17细胞方向分化；如周围环境中仅TGF-β浓度高时，初始T细胞向Treg细胞方向分化[11]。Th17/Treg比值越大，提示机体炎症反应状态越严重[12]。

本研究对不同病情程度的COPD患者的肺功能、外周血细胞炎症因子水平、Th17/Treg比值等情况进行对比分析，发现随着COPD病情的加重，患者FEV1%、FVC%、FEV1/FVC比值也发生变化，对照组>中度COPD组>重度COPD组>极重度COPD组。这一结果提示，随着COPD病情的加重，患者肺功能呈现进行性下降的趋势，这一点与已有的临床研究结论一致。

对不同病情COPD患者外周血中Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值进行对比分析发现，随着COPD病情的加重，患者外周血中Th17细胞、Th17/Treg比值对照组<中度COPD组<重度COPD组<极重度COPD组，而外周血Treg细胞对照组>中度COPD组>重度COPD组>极重度COPD组，且外周血Th17细胞、Treg细胞相关细胞因子变化具有一致性。这一结果提示，随着COPD病情的加重，患者外周血中Th17细胞、Th17/Treg比值进行性升高，Treg细胞进行性下降，机体炎症反应程度不断加重。

对不同病情COPD患者外周血中炎性细胞因子水平进行对比分析发现，中度、重度和极重度COPD组患者的外周血IL-17A、IL-1β、IL-6均显著高于对照组，外周血IL-10显著低于对照组。在COPD患者间，随着病情加重，外周血中IL-17A、IL-1β、IL-6值对照组<中度COPD组<重度COPD组<极重度COPD组，外周血IL-10值对照组>中度COPD组>重度COPD组对于极重度COPD组，这一结果提示，随着COPD病情的加重，患者机体炎症反应程度不断加重。

相关性分析结果发现，COPD患者的肺功能指标FEV1%、FVC%、FEV1/FVC与外周血中Th17细胞、Th17/Treg比值呈显著的负相关关系，肺功能指标FEV1%、FVC%、FEV1/FVC与外周血Treg比值呈显著的正相关关系。本研究结果表明，COPD外周血Th17/Treg比值与患者肺功能下降具有显著的相关性。

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[收稿2016-01-18 修回2016-02-14]

(编辑 张晓舟)

Relationship of immune response and immune imbalance mediated by Th17 cells and Treg cells with pulmonary function in COPD patients

MEN Xiang，SHANG Xi-Yu.

Department of Respiratory Medicine, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000,China

Objective:To investigate the relationship of the immune response and immune imbalance mediated by Th17 cells and Treg cells with pulmonary function in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patients.Methods:90 COPD patients and 45 healthy volunteers with matched age and sex were selected.The COPD patients were divided into 2 groups according to the patient's condition.45 healthy volunteers were collected as the control group.The lung function, Th17 cells, Treg cells and serum levels of inflammatory cytokines were detected and compared.Results:In COPD patients, the FEV1%, FVC%, FEV1/FVC, Th17,Th17/Treg and inflammatory cytokines had increased in an order of moderate COPD, severe COPD and very severe COPD (P<0.05).Treg had increased in an order of very severe COPD, severe COPD and moderate COPD (P<0.05).FEV1%, FVC% and FEV1/FVC were negatively correlated with Th17 and Th17/Treg (P<0.05).FEV1%, FVC% and FEV1/FVC were positively correlated with Treg (P<0.05).Conclusion:Th17/Treg in peripheral blood of COPD patients is significantly correlated with the decrease of pulmonary function.

Chronic obstructive pulmonary disease;Th17 cells;Regulatory T cells;Immune response;Pulmonary function

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.022

门 翔(1980年-)，女，硕士，主治医师，主要从事呼吸内科，E-mail：mmmxxx_11@sina.com。

及指导教师：尚喜雨(1969年-)，女，硕士，副教授，主要从事肿瘤学方面的研究，E-mail：shangxiyu163@163.com。

R730.3

A

1000-484X(2016)12-1826-04

①河南省南阳医学高等专科学校基础部，南阳473000。