BALB/c小鼠免疫重组蓖麻毒素B链蛋白的免疫机制研究①

王俊虹 吴 绘 魏茂提

(武警后勤学院，天津300309)

BALB/c小鼠免疫重组蓖麻毒素B链蛋白的免疫机制研究①

王俊虹 吴 绘 魏茂提②

(武警后勤学院，天津300309)

目的：探讨重组蓖麻毒素B链蛋白(rRTB)免疫雌性BALB/c小鼠的免疫机制。方法：雌性BALB/c小鼠分为rRTB组和PBS组，间隔14 d皮下多点注射，共4次。间接ELISA分析小鼠血清抗体效价和抗体分型，采用流式细胞仪检测脾细胞因子IFN-γ和IL-4。结果：血清IgG效价达到1∶107以上，且攻毒后产生二次免疫应答，与PBS对照组差别有统计学意义(P<0.05)；IgG1达到1∶105以上，与PBS对照组差别有统计学意义(P<0.05)；IgG2a未发生明显变化。细胞因子检测结果表明IFN-γ的表达量与PBS组差异无统计学意义，而IL-4的表达量显著提高(P<0.05)。结论：rRTB蛋白免疫可刺激小鼠产生高水平的特异性抗体和细胞因子，诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答，为候选疫苗的研制奠定基础。

蓖麻毒素；B链蛋白；免疫应答；生物恐怖

蓖麻毒素(Ricin toxin,RT)是一种广泛存在的植物性毒素，属于Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP)，由A、B两条链构成，A链(RTA)具有使核糖体失活的能力，是毒性链，B链(RTB)是一种半乳糖结合型蛋白，是结合链[1]。RT具有很强的毒性作用，几乎可以和所有的真核细胞结合，因此是标准的毒素战剂和生物恐怖剂[2]。随着多个恐怖组织研制RT的消息频频出现[3]，发展安全、有效的防治方法就显得尤为重要，已成为世界各国研究的热点。

目前关于RT的疫苗研究主要集中在类毒素[4]和A链蛋白[5-8]，而关于B链蛋白的疫苗研制较少。本室制备的重组蛋白rRTB(E.coliM15/pQE80L-RTB诱导表达)经小鼠攻毒保护实验和体外中和实验，结果说明rRTB可以完全抵抗5×LD50剂量的天然RT攻毒[9]。本研究旨在利用rRTB皮下多点免疫雌性BALB/c小鼠，探讨其免疫机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 重组蛋白和天然毒素 重组蛋白rRTB(E.coliM15/pQE80L-RTB表达、纯化获得)、天然RT均由我室制备。

1.1.2 主要试剂和仪器 山羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a(HRP标记)、ELISA用显色液均购自北京天根生物公司；其他化学试剂为国产分析纯。液相内毒素清除剂(北京天恩泽基因科技有限公司)；Coulter Epics XL型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.1.3 实验动物 6～8周龄雌性BALB/c小鼠，体重18～20 g(军事医学科学院实验动物中心)，动物质量合格证号：SCXK-(军)2014-005。

1.2 方法

1.2.1 免疫接种 小鼠分为4组，每组5只。25 μg/只rRTB溶液皮下多点注射(PBS稀释)，共4免，间隔周期14 d。

1.2.2 血清抗体和抗体亚型检测 ①每次免疫一周、攻毒后一周尾静脉取血，室温留取血清，-20℃保存。②包被酶标板：RTB浓度为5 μg/ml，包被液稀释，100 μl/孔。③间接ELISA法检测：二抗抗体分别为HRP标记羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a(1∶5 000稀释)。④酶标仪读取A450的吸光度。

1.2.3 IFN-γ、IL-4检测 ①去除内毒素：按说明书操作。②脾淋巴细胞培养：在四免后一周，随机选取免疫小鼠5只，颈椎脱臼处死后无菌取脾脏，剪碎、研磨挤压成单细胞悬液后，离心、弃掉上清，溶红细胞30 s后PBS洗2次，吹打均匀，以台盼兰拒染法进行活细胞计数，要求活细胞数在90%以上；加1 ml 1640细胞培养基(10%FBS)重悬，调整细胞至1×107个/ml。③流式细胞术检测细胞因子：24孔板中加入细胞(2～4)×107个/孔；CD28 1 μg/ml；CD49d 1 μg/ml；GolgiStop 1 μg/ml；rRTB蛋白浓度和作用时间采用2×2析因设计实验方法进行优化；1640细胞培养基(10%FBS)至1.5 ml终体积。经作用后，1 500 r/min离心5 min后弃上清收集细胞，加入工作浓度的BD固定/透膜液250 μl重悬，4℃避光20 min；1 500 r/min离心5 min后弃上清，150 μl PBS重悬细胞，分为3管分别加入不同组合的单克隆抗体(CD3e-FITC、CD4-PECY5、CD8-APC、IFNγ-PE、IL-4-PE、Rat IgG1-PE)，避光4℃反应30 min。各管加入1 ml PBS重悬，1 500 r/min离心5 min后弃上清，重复2次；加入4%多聚甲醛150 μl，避光4℃保存，1周内用流式细胞仪分析。

1.3 统计学分析 数据经SPSS17.0和Graphpad软件进行统计。抗体效价经几何均数数据变换后用方差分析。计量资料采用成组t检验、秩和检验、析因设计的方差分析；计数资料采用一般χ2和Fisher精确检验进行统计分析。

2 结果

2.1 IgG、IgG1、IgG2a分析 经四次免疫后，小鼠血清IgG效价达到1∶107，攻毒后产生了二次免疫应答；IgG1的效价可达到1∶106，而IgG2a的血清效价最高只可达1∶102。PBS组血清IgG、IgG1、IgG2a则无明显变化(图1)。

2.2 细胞因子检测

2.2.1 作用条件的优化 rRTB免疫小鼠脾细胞因子IFN-γ和IL-4的检测经析因设计方差分析确定蛋白的最佳刺激剂量和作用时间。表1结果表明：蛋白刺激剂量(10、20 μg/ml)和作用时间(12、24 h)两个主效应对细胞因子IFN-γ和同型对照IgG1无统计学差异(P>0.05)；对IL-4的表达有显著性差异(P<0.05)，即在蛋白刺激剂量为10 μg/ml、作用时间为12 h时表达量最高。

2.2.2 IFN-γ、IL-4的检测 图2显示rRTB剂量为10 μg/ml、作用时间为12 h的刺激条件下，细胞因子IL-4的表达量与同型对照IgG1组比较有显著性差异(P<0.05)，而IFN-γ表达量差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 不同时期血清中抗体效价水平Fig.1 Antibody titers of sera after each immunization and challenge trial

GroupsIFN⁃γ12h24hIL⁃412h24hIgG112h24h10μg/ml311±097244±0582114±4011891±274243±071251±06320μg/ml291±066324±0921166±355708±235301±081198±055

图2 rRTB免疫小鼠脾脏细胞因子水平Fig.2 Levels of cytokine of rRTB in spleen after immunity

3 讨论

作为重要的潜在性生物恐怖剂，RT的发展具有广泛的民用价值和军事意义。由于RT具有来源广泛、制备容易、毒性高的特点，易被恐怖分子利用，因此发展有效的防治手段，研发有效的预防性疫苗，已成为国际上研究的趋势，美军传染病医学研究所(USAMRIID)一直致力于毒素预防措施的研究[10]。

RT相关的生防疫苗研制主要集中在类毒素和基于A链亚单位。其中，经甲醛化处理后的全毒素能有效抵抗致死剂量的毒素攻毒[3]。RiVax是基于A链亚单位的突变体，由美国Texas大学Vitetta科研小组研发，在不使用佐剂的情况下，可以抵抗经腹腔摄入的10×LD50的天然毒素的攻击，由于可冻干保存而适用于军队使用。在我国，2008年韩艳辉等[7]将RTA突变体和相思子毒素A链(ATA)突变体嵌合表达，获得二价候选疫苗，该疫苗能抵抗致死剂量的天然AT和RT混合物攻毒。然而，上述两种疫苗均由于安全问题而未能在人体使用。

本室采用E.coliM15/pQE80L-RTB表达、纯化获得的重组蛋白rRTB，经小鼠攻毒保护实验和体外中和实验，结果说明rRTB皮下多点注射雌性BALB/c小鼠，25 μg/只，免疫4次(间隔14 d免疫)，可以完全抵抗5×LD50剂量的天然RT攻毒，本实验则进一步探讨其免疫机制。小鼠血清IgG和抗体亚型分析结果显示：四免后IgG的效价达107以上，IgG1为106，且攻毒后产生二次免疫应答，均与PBS组差异有显著性(P<0.05)；而IgG2a则无明显

变化。应用流式细胞技术进行脾细胞中Th1类细胞因子(IFN-γ)、Th2类细胞因子(IL-4)的检测，结果表明IFN-γ表达量无显著性差异(P>0.05)，而IL-4的表达量有显著性提高(P<0.05)。以上结果提示：重组蛋白rRTB免疫小鼠后能诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答，但不能诱导IgG2a和Th1优势应答，这为进一步研究蓖麻毒素B链疫苗奠定了基础。

[1] Joachim S,Alexander W,Matthias FM.Ribosome-inactivating and related proteins [J].Toxins (Basel),2015,7(5):1556-1615.

[2] Vance DJ,Greene CJ,Rong Y,etal.Comparative adjuvant effects of type II heat-labile enterotoxins in combination with two different candidate ricin toxin vaccine antigens [J].Clin Vaccine Immunol,2015,22(12):1285-1293.

[3] Dong N,Luo L,Wu J,etal.Monoclonal antibody,mAb 4C13,an effective detoxicant antibody against ricin poisoning [J].Vaccine,2015,33(32):3836-3842.

[4] Han YH,Gao S,Xin WW,etal.A recombinant mutant abrin A chain expressed in Escherichia coli can be used as an effective vaccine candidate [J].Hum Vaccin Immunother,2011,7(8):838-844.

[5] Wang JH,Gao S,Zhang T,etal.A recombinant chimeric protein containing B chains of ricin and abrin is an effective vaccine candidate [J].Hum Vaccin Immunother,2014,10(4):1-7.

[6] Zhang T,Kang L,Gao S,etal.Truncated abrin A chain expressed in Escherichia coli:A promising vaccine candidate[J].Hum Vaccin Immunother,2014,10(9):2648-2655.

[7] 韩艳辉,张 弢,康 琳,等.重组蓖麻、相思子毒素A链嵌合突变体的制备与分析 [J].生物技术通讯,2011,22(4):453-457.

[8] Marconescu PS,Smallshaw JE,Pop LM,etal.Intradermal administration of Rivax protects mice from mucosal and systemic ricin intoxication [J].Vaccine,2010,28(32):5315-5322.

[9] Hansel TT,Kropshofer H,Singer T,etal.The safety and side effects of monoclonal antibodies [J].Nat Rev Drug Discov,2010,9(4):325-338.

[10] Abboud N,Chow SK,Saylor C,etal.A requirement for FcR in antibody-mediated bacterial toxin neutralization [J].J Exp Med,2010,207(11):2395-2405.

[收稿2016-10-27]

(编辑 倪 鹏)

Study on immune mechanism of a recombinant ricin B chain protein against ricin intoxication in BALB/c mice

WANG Jun-Hong,WU Hui,WEI Mao-Ti.

Logistics University of PAP，Tianjin 300309，China

Objective:To explore the immunity provided to BALB/c mice by immunization with the recombinant ricin B chain protein (rRTB).Methods:Female BALB/c mice were randomly selected into rRTB-vaccinated group and PBS group.Mice were subcutaneously (s.c.) injected four times with 14 days immunization time interval.Changes of antibodies (IgG,IgG1and IgG2a) in serum were detected by ELISA.Meanwhile,the expression of IL-4 and IFN-γ were detected by flow cytometry.Results:The mean IgG titers reached 106after the fourth immunization and a strong secondary response was induced in vaccinated mice when challenged with toxin.There was significant difference between rRTB-vaccinated group and PBS group (P<0.05).The same result was shown in IgG1.However,no changed was detected in IgG2a.Meanwhile,there was significant difference for IL-4 between two groups (P<0.05),while no significant difference for IFN-γ was observed.Conclusion:rRTB can produce higher levels of antigen-specific antibodies (IgG and IgG1),and cytokine (IL-4) of splenocytes,which means the recombinant protein can induce the Th2-type immune response and trigger a good immune response.rRTB may be a potentially valuable vaccine candidate against human exposure to AT.

Ricin toxin;B chain protein;Immune response;Bioterrorism

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.006

①本文受武警后勤学院开放基金项目(WHKF201503)和军事预防医学“2110”三期工程建设项目资助。

王俊虹(1977年-)，女，博士，讲师，主要从事生物战剂的侦检与防治方面研究，E-mail：wangjunhong11007@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)12-1758-03

②天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津300309。