SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1炎性体表达中的作用①

王 波 喻思扬 刘 洋 王 燕 徐健强 曾高峰 赵国军

(南华大学附属第二医院心血管内科，衡阳421000)

SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1炎性体表达中的作用①

王 波 喻思扬②刘 洋 王 燕③徐健强 曾高峰 赵国军④

(南华大学附属第二医院心血管内科，衡阳421000)

目的：探讨固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)在阿托伐他汀抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎性体表达中的作用。方法：160 nmol/L佛波酯孵育THP-1细胞12 h，使其分化为巨噬细胞，更换无血清培养基，加入脂多糖和(或)阿托伐他汀进行处理。Real-time PCR检测细胞中NLRP1、SREBP1 mRNA的表达；Western blot检测细胞中NLRP1、SREBP1蛋白的表达；检测SREBP1 siRNA预处理细胞后对阿托伐他汀抑制NLRP1表达的影响。结果：阿托伐他汀能抑制THP-1巨噬细胞NLRP1和SREBP1的mRNA和蛋白的表达；单独使用SREBP1 siRNA处理细胞可有效抑制NLRP1的表达，且与单独使用阿托伐他汀无明显差异；同时使用SREBP1 siRNA和阿托伐他汀处理细胞比单独使用一种对NLRP1的抑制作用更为显著。结论：阿托伐他汀可能通过SREBP1途径抑制NLRP1的表达，进而发挥抗炎效应。

阿托伐他汀；抗炎作用；SREBP1；NLRP1炎性体；动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)是一种由脂质代谢紊乱和免疫过度激活共同介导的血管壁慢性炎症性疾病[1]。与As相关的心脑血管事件已经成为了威胁人类健康的重要杀手。阿托伐他汀具有强效降脂作用，临床上已被广泛用于As的预防与治疗。近年来，有研究发现阿托伐他汀可通过抑制白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)等炎症因子的分泌，延缓As发展及血栓形成，揭示了阿托伐他汀的抗炎效应[2,3]。但是，其中所涉及的机制目前尚不清楚。

炎性体是一种细胞内的多蛋白寡聚体，参与机体免疫应答和炎症反应，其活化后可介导半胱天冬酶-1加工前体IL-1β和前体IL-18，使他们转化为成熟的炎症因子[4]。作为最早被发现的炎性体，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1)炎性体广泛存在于巨噬细胞内，并在As中扮演着关键角色[5]。固醇调节元件结合蛋白1(Sterol regulatory element binding protein-1，SREBP1)亦是As的重要参与者，它不仅能促进巨噬细胞内脂质的合成，还能调控NLRP1的表达[6]。本研究旨在探讨阿托伐他汀能否通过SREBP1途径抑制NLRP1的表达，剖析阿托伐他汀的抗炎机制，以期为As的防治带来新的启示。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂 人单核细胞系THP-1细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞中心；RPMI1640培养基、胎牛血清、佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)购自Sigma公司；阿托伐他汀钙购自大连美仑生物技术有限公司；RNA抽提试剂购自GeneCopoeia公司；Reverse Transcription System购自Promega公司；TaqMan®Gene Expression Mast-er Mix购自Applied Biosystems公司；NLRP1、SREBP1、β-actin引物均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；NLRP1兔抗人一抗购自Life technologies公司；SREBP1兔抗人一抗购自BioVision公司；β-actin兔抗人一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自ImmuneChem公司；jetTEI转染试剂购自Polyplus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将THP-1细胞接种在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中(含青霉素和链霉素各1.0×105U/L)，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱内培养。培养2～4代后，将状态良好、呈对数生长的细胞转种于6孔细胞培养板中。每次实验前用终浓度为160 nmol/L的PMA处理细胞12 h，诱导其分化成巨噬细胞后，更换无血清培养基，按照实验分组，予以相应处理因素。

1.2.2 Real-time PCR检测细胞中NLRP1、SREBP1 mRNA的表达 收集经各种因素处理后的THP-1细胞，使用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA后，使用Roche LightCycler® 96荧光定量仪进行Real-time PCR。反应条件：95℃ 5 min，95℃ 15 s，65℃ 35 s，进行40个循环。分析基因扩增的平均Ct值，以β-actin为内参，采用公式2-ΔΔCt计算各目的基因的相对表达量。各基因引物序列如下：NLRP1上游引物为5′-CCACAACCCTCTGTCTACATTAC-3′，下游引物为5′-GCCCCATCTAACCCATGCTTC-3′；SREBP1上游引物为5′-CGGCGCTGCTGACCGACATC-3′，下游引物为5′-CCCTGCCCCACTCCCAGCAT-3′；β-actin上游引物为5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，下游5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。

1.2.3 Western blot检测细胞中NLRP1、SREBP1蛋白的表达 收集经各种因素处理后的细胞样本，PBS洗涤后加入含PMSF的细胞裂解液，冰上放置30 min，4℃ 12 000 r/min离心5 min后，取上清保存于-20℃冰箱备用。将上清与4×SDS上样缓冲液按3∶1比例混匀，煮沸5 min后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，然后转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后加入一抗，37℃孵育1 h，TBST反复洗涤后加入二抗，37℃孵育2 h，TBST反复洗涤后使用ECL试剂盒进行化学发光检测。

1.2.4 SREBP1 siRNA转染 在GenBank中查找人SREBP1 mRNA基因序列，按照siRNA的设计原则设计引物(正义链序列为5′-UGACUUCCCUGGCCUAUUUUU-3′；反义链序列为5′-AAAUAGGCCAGGGAAGUCAUU-3′)，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将状态良好、处于对数生长期的THP-1细胞转种于6孔细胞培养板中，经PMA诱导分化为巨噬细胞。参照Polyplus公司的jetTEI转染试剂说明书，将siRNA加入各孔内，置于培养箱中孵育6 h后，更换新鲜培养基继续孵育48 h，采用Western blot确认干扰效果。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对THP-1巨噬细胞NLRP1表达的影响 THP-1巨噬细胞经10 ng/ml LPS或(和)10 μmol/L阿托伐他汀孵育24 h后，提取总RNA和总蛋白，分别采用荧光定量PCR和Western blot检测细胞内NLRP1的mRNA(图1A)和蛋白(图1B)表达。结果显示：与对照组比较，LPS组NLRP1的mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05)；与单纯LPS组比较，LPS+阿托伐他汀组NLRP1的mRNA和蛋白表达显著减少(P<0.05)，表明阿托伐他汀可抑制LPS诱导的THP-1巨噬细胞NLRP1的表达。

2.2 阿托伐他汀对THP-1巨噬细胞SREBP1表达的影响 以10 ng/ml LPS及不同浓度(1、10、100 μmol/L)的阿托伐他汀处理THP-1巨噬细胞24 h，提取总RNA和总蛋白，分别采用荧光定量PCR和Western blot检测细胞内SREBP1的mRNA(图2A)和蛋白(图2B)表达。结果显示：与对照组比较，LPS组SREBP1的mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05)；与单纯LPS组比较，LPS+阿托伐他汀共处理细胞可使SREBP1的mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)，且阿托伐他汀浓度越大，下降越明显，表明阿托伐他汀可呈浓度依赖性抑制THP-1巨噬细胞SREBP1的表达。

图1 阿托伐他汀对THP-1巨噬细胞NLRP1表达的影响Fig.1 Effect of atorvastatin on NLRP1 expression in THP-1 macrophagesNote:Compared with untreated control group,* .P<0.05;compared with LPS group,# .P<0.05.n=3.

图2 阿托伐他汀对THP-1巨噬细胞SREBP1表达的影响Fig.2 Effect of atorvastatin on SREBP1 expression in THP-1 macrophagesNote:Compared with untreated control group,* .P<0.05;compared with LPS group,# .P<0.05.n=3.

同样，以10 ng/ml LPS及10 μmol/L阿托伐他汀孵育THP-1巨噬细胞不同时间(12、24、48 h)，提取总RNA和总蛋白，分别采用荧光定量PCR和Western blot检测细胞内SREBP1的mRNA(图2C)和蛋白(图2D)表达。结果显示：与对照组比较，LPS组SREBP1的mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05)；与单纯LPS组比较，LPS+阿托伐他汀共处理细胞可使SREBP1的mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)，且阿托伐他汀作用时间越长，下降越明显，表明阿托伐他汀可呈时间依赖性抑制THP-1巨噬细胞SREBP1的表达。

2.3 SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1表达中的作用 为了进一步研究SREBP1在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬细胞NLRP1表达中的作用，我们转染SREBP1 siRNA以沉默SREBP1的表达(图3A)，然后观察其对细胞内NLRP1 mRNA(图3B)和蛋白(图3C)表达的影响。结果显示：LPS可使NLRP1的表达显著增加(P<0.05)；而单独使用SREBP1 siRNA处理细胞可有效抑制LPS诱导的NLRP1表达(P<0.05)，且与单独使用阿托伐他汀无明显差异；此外，同时使用SREBP1 siRNA和阿托伐他汀处理细胞比单独使用一种对NLRP1的抑制作用更为显著(P<0.05)。

图3 SREBP1 siRNA对阿托伐他汀抑制THP-1巨噬细胞NLRP1表达的影响Fig.3 Effect of SREBP1 siRNA on atorvastatin-induced reduction of NLRP1 expression in THP-1 macrophagesNote:Compared with LPS group,* .P<0.05;compared with LPS+ATO group,# .P<0.05;compared with LPS+SREBP1 siRNA,△.P<0.05.n=3.

3 讨论

炎症在As发生发展中起重要作用。阿托伐他汀已被证实可以下调高敏C-反应蛋白等机体炎症标记物的水平，发挥抗炎作用，进而降低心血管风险[7]。然而，目前关于阿托伐他汀抗炎机制的报道则相对甚少。本研究以THP-1源性巨噬细胞为研究对象，首先论证了阿托伐他汀可明显抑制NLRP1的mRNA和蛋白表达；其次，我们观察了阿托伐他汀对NLRP1上游转录因子SREBP1表达的影响，结果显示阿托伐他汀亦可抑制SREBP1的mRNA和蛋白表达，且这种效应呈浓度和时间依赖性；此外，为了进一步研究SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1表达中的作用，我们运用siRNA对SREBP1进行沉默，发现SREBP1 siRNA和阿托伐他汀同时处理细胞比单独使用一种对NLRP1的抑制作用更为显著。因此，我们推断阿托伐他汀可能通过SREBP1途径抑制NLRP1的表达，进而发挥抗炎效应。

NLRP1炎性体几乎存在于所有哺乳动物的细胞内，作为机体固有免疫系统的重要组成部分，其不仅可被LPS、胞壁酰二肽等细菌蛋白激活，启动宿主抗病原反应，而且还参与白癜风、风湿性关节炎和系统性硬化病等自身免疫性、炎症性疾病的发生发展[8]。此外，越来越多的研究发现NLRP1炎性体亦与As密切关联。周围动脉疾病(Peripheral arterial disease，PAD)是一种多发于老年人的As疾病，常累及下肢，可诱发心脏病和脑卒中。研究显示NLRP1炎性体的过度激活贯穿PAD始终，除了参与早期的内皮紊乱和炎症反应外，其亦与后期的血管再生和组织修复密不可分[9]。阿司匹林可有效对抗氧化应激介导的内皮功能紊乱，并能抑制与血小板相关的炎症反应，是治疗PAD的经典药物之一。近期有学者指出，阿司匹林可显著降低PAD患者的NLRP1水平，这进一步证实了NLRP1炎性体与As的关联性，并为标靶NLRP1炎性体治疗As提供了理论依据[10]。我们的实验结果显示LPS可使THP-1巨噬细胞NLRP1的mRNA和蛋白表达显著上调，且这种效应能被阿托伐他汀明显削弱，提示阿托伐他汀可抑制NLRP1的表达，但是，阿托伐他汀是通过何种途径作用于NLRP1，目前尚不清楚。

固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element binding protein，SREBP)是一类存在于哺乳动物细胞内、参与调节细胞脂质水平的转录因子，包括SREBP1和SREBP2[11]。其中SREBP1已被证实是NLRP1上游重要的调控因子，SREBP1基因的缺失可导致巨噬细胞NLRP1的表达和下游炎症因子的合成显著减少[6]。有研究发现阿托伐他汀可通过SREBP1途径调节脂质代谢、改善内皮功能紊乱，从而延缓As的发生发展[12,13]。与之相符，我们的实验结果显示阿托伐他汀能有效抑制LPS诱导的THP-1巨噬细胞SREBP1的表达，且这种效应呈浓度和时间依赖性。此外，为了进一步研究SREBP1在阿托伐他汀抑制NLRP1表达中的作用，我们通过转染SREBP1 siRNA以沉默THP-1巨噬细胞内SREBP1的表达，结果发现SREBP1表达下调后，NLRP1的表达水平亦明显下降，且这种效应与单独使用阿托伐他汀无明显差异；另外，我们还发现同时使用SREBP1 siRNA和阿托伐他汀处理细胞比单独使用一种对NLRP1的抑制作用更为显著。因此我们推断阿托伐他汀很可能通过SREBP1途径抑制NLRP1的表达。然而，关于阿托伐他汀是否亦能通过其他途径作用于NLRP1炎性体，目前不甚清楚。

综上所述，NLRP1炎性体是机体固有免疫应答和炎症反应的重要调节器，参与As发生发展。本研究显示阿托伐他汀可能通过SREBP1途径抑制NLRP1的表达，在一定程度上阐明了阿托伐他汀的抗炎机制。但是，近期有文献报道SREBP1与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性体的激活密切相关[14]。考虑到NLRP3炎性体在As中的作用尚存争议[9,15]，且SREBP2已被证实是NLRP3炎性体主要的上游调控因子[16,17]，故本文并未涉及SREBP2-NLRP3途径的有关内容。随着对炎性体及其上游调控机制研究的不断发展，我们将更全面、更深入地了解As的发病机制，为As的早期诊断、预防和治疗带来新的启示。

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[收稿2016-03-09]

(编辑 倪 鹏)

Role of SREBP1 in atorvastatin-induced reduction of NLRP1 inflammasome expression

WANG Bo,YU Si-Yang,LIU Yang,WANG Yan,XU Jian-Qiang,ZENG Gao-Feng,ZHAO Guo-Jun.

Department of Cardiovascular Medicine,the Second Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang 421000,China

Objective:To investigate the role of sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP1) in atorvastatin-induced reduction of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1 (NLRP1) inflammasome expression.Methods:THP-1 cells were treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (160 nmol/L) for 12 h to be differentiated into macrophages.The medium was then replaced with serum-free medium containing lipopolysaccharide and (or) atorvastatin.The mRNA expression of NLRP1 and SREBP1 were detected by Real-time PCR.The protein expression of NLRP1 and SREBP1 were determined by Western blot.Furthermore,we observed the effect of SREBP1 siRNA on atorvastatin-induced reduction of NLRP1 expression.Results:Atorvastatin inhibited the mRNA and protein expression of NLRP1 and SREBP1 in the THP-1 macrophages.SREBP1 siRNA showed no significant difference on lowering NLRP1 expression when compared with atorvastatin.Treating cells with SREBP1 siRNA and atorvastatin at the same time resulted in more obvious reduction of NLRP1 expression than single use of SREBP1 siRNA or atorvastatin.Conclusion:Atorvastatin might exert anti-inflammatory effect by repressing NLRP1 expression through the SREBP1 pathway.

Atorvastatin;Anti-inflammatory effect;SREBP1;NLRP1 inflammasome;Atherosclerosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.018

王 波(1977年-)，男，硕士，主治医生，主要从事动脉粥样硬化病因与防治方面研究，E-mail：653139732@qq.com。

及指导教师：曾高峰(1968年-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事动脉粥样硬化病因与防治方面的研究，E-mail：2379795177@qq.com。 赵国军(1978年-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事动脉粥样硬化病因与防治方面的研究，E-mail：zzhcsu@163.com。

R392.5

A

1000-484X(2016)12-1805-05

①本文为湖南省自然科学基金(No.14JJ5016)。

②共同第一作者。

③南华大学附属第二医院麻醉科，衡阳421000。

④桂林医学院组胚教研室，桂林541004。