盐酸吡格列酮对糖尿病大鼠肾组织TOLL受体4/MAPKs信号通路的影响

聂 鑫 余益本 文格波

(湖北医药学院附属东风医院老年病科，十堰442000)

盐酸吡格列酮对糖尿病大鼠肾组织TOLL受体4/MAPKs信号通路的影响

聂 鑫 余益本①②文格波②

(湖北医药学院附属东风医院老年病科，十堰442000)

目的：探讨吡格列酮对糖尿病肾病大鼠肾组织中TOLL受体4/MAPKs信号通路的影响。方法：将雄性SD随机分为对照组(n=8)和试验组(n=32)。试验组SD鼠造模成功后随机分为3组进行干预,应用Western blot检测对照组和干预组大鼠肾组织中丝裂原活化蛋白激酶ERK1/2及p38MAPK磷酸化水平。结果：与对照组比较，各组大鼠肾组织中TOLL受体4表达增强，其中ERK1/2与JNK磷酸化水平明显升高(P<0.05)，但p38MAPK水平变化不明显(P>0.05)；与模型组比较，吡咯列酮干预组大鼠肾组织中ERK1/2与p38MAPK磷酸化水平降低 (P<0.05)。结论：吡格列酮通过TOLL受体4/MAPKs/ERK1/2与TOLL受体4/MAPKs/JNK信号通路来完成，延缓糖尿病肾病的发生与发展。

盐酸吡格列酮；糖尿病肾病；TOLL受体4/MAPKs信号通路

糖尿病肾病是导致终末期肾衰竭的重要原因之一，目前认为糖尿病肾病受多方面因素的影响，包括遗传因素、血流动力学异常、高糖相关的生化代谢异常等。近年免疫、炎症学说备受关注，TLR(TOLL-like receptors，TLR)是促使免疫炎症反应加重的重要因素之一,发现TLR是介导免疫和炎症反应的桥梁[1]。我们在前期研究中，用盐酸吡格列酮对糖尿病大鼠进行干预后能减少肾组织微血管TOLL受体4表达[2]，但盐酸吡格列酮改善糖尿病肾脏疾病通过何种机制的报道尚不多见。现通过研究盐酸吡格列酮对糖尿病肾组织TOLL受体4/MAPKs下游信号蛋白磷酸化的表达，了解其治疗糖尿病肾病的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠40只，6周龄，体质量100～200 g，购自湖北医药学院附属东风医院动物实验部，许可证编号SCXK(鄂)2014-01346 ；链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司；盐酸吡格列酮(15 mg/片)由杭州中美华东制药有限公司提供；兔抗小鼠TOLL受体4、p-ERK、p-p38MAPK及p-JNK抗体由武汉宝曼公司提供。①40只雄性清洁级SD大鼠，喂养1周，随机分为正常对照组(n=8)和造模组(n=32)。将32只大鼠按50 mg/kg通过腹腔注射STZ，在72 h后测3次随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠模型，有24只大鼠造模成功，作为实验组(n=24)[3]。将成模大鼠随机分为3组，每组8只：模型组，小剂量吡格列酮组6 mg/(kg·d)，大剂量吡格列酮组12 mg/(kg·d)。②在造模成功后开始干预，实验组及正常对照组仅给予12 mg/(kg·d)生理盐水灌胃，低剂量组、高剂量组分别给予吡格列酮6、12 mg/(kg·d)灌胃。上午8点给药，连续8周。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠肾脏组织病理学分析 实验结束时，大鼠经氯胺酮麻醉后，取腹正中切口暴露双肾及腹主动脉，经腹主动脉插管，用冷PBS将双肾充分灌洗后，取左肾经肾门冠状面取组织，石蜡切片，厚4 μmol/L，行HE染色。送湖北医药学院附属东风医院病理教研室进行HE染色分析，了解大鼠肾脏组织病变情况。

1.2.2 Western blot检测蛋白的表达 检测大鼠肾组织，立即放入预冷的裂解缓冲液中，4℃超声粉碎，离心 30 min，取上清，Bradford 法测定蛋白浓度。用10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 分离蛋白质，电泳后将 PAGE凝胶中的蛋白质电转移至PVDF膜上，取出膜放至3% BSA 阻断缓冲液中，振荡封闭1 h，TBS洗膜 3 次，每次 10 min。将膜放入一抗中(抗体1∶500 稀释)，4℃过夜。10 min×3次洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(抗体1∶500 稀释) 37℃振荡 1 h，用大量 TBS液 10 min×3 次洗膜后用 ECL试剂暗室内胶片曝光,测定TOLL受体4,经X胶片曝光显影，并用GIS1000分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

2 结果

2.1 大鼠肾脏组织病理改变 光镜下观察：正常对照组大鼠肾脏表面光滑，形状正常；光镜下见肾小球结构清晰，球囊壁光滑，未见增大及萎缩；肾小管上皮细胞呈方形，大小整齐一致；基底膜完整，间质中无纤维组织增生，炎症细胞浸润。模型组多数大鼠肾脏体积增大，光镜下肾小球肥大，肾小球明显充血、肿胀，肾小球内细胞数目明显增多,基底膜不规则增厚、皱曲，肾小囊腔变窄，部分肾小管亦明显扩张，上皮细胞破碎程度加深、明显水肿。小剂量吡格列酮组大鼠肾组织系膜基质增生减轻，少数肾小管扩张，上皮细胞水肿减轻，糖原空泡减少。大剂量吡格列酮组大鼠肾组织系膜基质增生明显减轻，肾小管无扩张，上皮细胞轻微水肿。见图1。

2.2 大鼠肾脏组织中TOLL受体4蛋白的表达 正常对照组大鼠肾脏组织TOLL受体4蛋白表达较弱,与正常对照组比较,模型组、小剂量吡格列酮组、大剂量吡格列酮组TOLL受体4表达明显增强,有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较, 小剂量吡格列酮组、大剂量吡格列酮组TOLL受体4蛋白表达明显减弱,有统计学意义(P<0.05)，见图2、3。

图1 大鼠肾组织HE染色(HE，×400)Fig.1 HE staining of rat renal tissues(HE,×400)Note:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

图2 Western blot 免疫印迹检测大鼠肾组织中TOLL受体4蛋白表达Fig.2 Expression of TOLL-like receptor 4 protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

图3 大鼠组织TOLL受体4蛋白表达的比较Fig.3 Comparison of four groups′ expression of TOLL-like receptor 4 protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05,compared with model group,#.P<0.05.A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

图4 Western blot免疫印迹检测大鼠肾组织ERK1/2表达变化Fig.4 Expression of ERK1/2 protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

图5 大鼠肾组织ERK1/2表达的比较Fig.5 Comparison of four groups′ expression of ERK1/2 protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

2.3 糖尿病大鼠肾脏组织中TOLL样受体4/MAPKs信号通路被激活 Western blot检测发现，与正常组比较，其余3组大鼠肾组织ERK1/2与p38MAPK磷酸化水平明显升高(P<0.05)，其中模型组大鼠肾组织ERK1/2是正常对照组的5倍，而JNK水平变化不明显(P>0.05)，见图4～7。结果显示糖尿病大鼠肾组织TOLL受体4/MAPKs信号通路处于激活状态。

图6 Western blot免疫印迹检测大鼠肾组织p38MAPK表达变化Fig.6 Expression of p38MAPK protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

图7 大鼠肾组织p38MAPK表达的比较Fig.7 Comparison of four groups′ of expression of p38MAPK protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group，#.P<0.05.

图8 Western blot免疫印迹检测大鼠肾组织JNK表达变化Fig.8 Expression of JNK protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

2.4 盐酸吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏组织中TOLL受体4/MAPKs信号通路的影响 与模型组比较，发现盐酸吡咯列酮干预组大鼠肾组织ERK1/2磷酸化水平降低 (P<0.05)，以10 mg/(kg·d)最明显(P<0.05) 。此外，Western blot免疫印迹检测发现干预组大鼠肾组织p38MAPK表达也有下降(P<0.05)，而JNK水平无明显变化(如图3、4、8、9)。

图9 大鼠肾组织JNK表达的比较Fig.9 Comparison of four groups′ expression of JNK protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

3 讨论

研究发现，大鼠肾组织TOLL受体4 的表达显著提高，其激活后，主要通过两条信号路径：TOLL受体4/NF-κB 和TOLL受体4/MAPKs，调节各种免疫和炎症介质的基因表达[4]。目前已经发现了几条并行的MAPKs有关的信号通路,分别为ERK1/2、JNK/SAPK和p38等[5]。研究表明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信号通路广泛存在于哺乳动物细胞中，导致一系列与糖尿病肾病相关的细胞因子、炎症因子、趋化因子等的合成与释放，加速了糖尿病肾病发生与发展[6，7]。我们研究发现，糖尿病大鼠肾组织TOLL受体4/MAPKs信号通路处于激活状态，主要由TOLL受体4/MAPKs/ERK1/2与TOLL受体4/MAPKs/p38MAPK两条下游信号通路参与糖尿病肾病的发生与发展。

噻唑烷二酮类药物(TZDs)盐酸吡格列酮与胰岛素抵抗、糖脂类代谢及肪细胞的分化关系密切，此外还具有抑制血管平滑肌细胞的增生和迁移，调节巨噬细胞中促炎症因子生成，抗动脉粥样硬化等生物学效应[8-11]。但盐酸吡格列酮是否对糖尿病大鼠肾脏组织TOLL受体4及其下游信号产生影响尚未见报道，研究在盐酸吡格列酮干预下，糖尿病大鼠肾组织TOLL受体4蛋白表达明显减弱，表明其能抑制TOLL受体4的活性[2]。为了进一步探究TOLL受体4/MAPKs信号通路在盐酸吡格列酮抗炎作用中的作用，测定了ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平。结果显示同糖尿病肾病模型组相比，干预组可以有效地抑制ERK1/2和p38MAPK的磷酸化，综合以上实验 ，TOLL受体4/MAPKs信号通路激活后，可能参与了糖尿病肾病病理发生发展,我们初步可认为盐酸吡格列酮能作为TOLL受体4的内源性药物靶点，使TOLL受体4表达减弱，进而减少ERK1/2和p38MAPK磷酸化来完成，延缓糖尿病肾病的进展。综上所述，初步证实了TOLL受体4/MAPKs/ERK1/2与TOLL受体4/MAPKs/p38MAPK信号通路的激活可能参与了糖尿病肾病病理进程，但TOLL受体4/MAPKs信号通路激活后是如何进一步影响糖尿病肾病的进程有待研究证明。

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[收稿2016-03-03 修回2016-04-29]

(编辑 许四平)

Role of TOLL-like receptor 4/MAPKs pathway of renal tissue in diabetic rats by pioglitazone

NIE Xin,YU Yi-Ben,WEN Ge-Bo.

Department of Gerontology,the Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China

Objective:To study the role of TOLL-like receptor4/MAPKs pathway of renal tissue in the diabetic rats treated with piogitazone.Methods:The male Sprague Dawlry rats were randomly selected as the control group (n=8) and experimental group(n=32).The experimental rats were randomly divided into three groups.The expression of ERK1/2,JNK and p38MAPK,and levels of their phosphorylation in kidney were measured by Western blot in control group and experimental group.Results:The expression of TOLL-like receptor 4 in all renal tissue in the diabetic rats were significantlyincreased than those in control group (P<0.01).Compared with the control group.The activity of p-ERK1/2 and p38MAPK significantly increased in each experimental group (P<0.05),but the expression level of p-JNK was no statistical significance.TOLL-like receptor 4 could regulatory effect on the phorylation of ERK1/2 and p38MAPK.Compared with the model group,the expression of p-ERK1/2 and p38MAPK significantly decreased(P<0.05),moreover,these changes were more significant in high-dose treated group (P<0.05).Conclusion:Pioglitazone inhibits the expression of TOLL-like receptor 4 of renal tissue in the diabetic rats,and these effects may be related to TOLL-like receptor 4/ERK1/2 and TOLL-like receptor 4/p38MAPK pathways.

Pioglitazone;Diabetic nephropathy;TOLL-like receptor 4/MAPKs signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.009

聂 鑫(1970年-)，女，硕士，主要从事糖尿病及其并发症的研究，E-mail：niexin1970@163.com。

及指导教师：余益本(1986年-)，男，硕士，主要从事糖尿病血管病变分子免疫机理方面的研究，E-mail：yuyiben@126.com。

R392.5

A

1000-484X(2016)12-1769-04

①南华大学病原生物学重点实验室，衡阳421001。

②南华大学国家临床医学研究中心，衡阳421001。