RAC1基因多态性对Rac1-GTP蛋白表达水平的影响①

刘亚妮 周嘉黎 杨春晓 罗小梅 杨婷玉 张 玉 师少军 黄怡菲

(华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉430022)

·基础免疫学·

RAC1基因多态性对Rac1-GTP蛋白表达水平的影响①

刘亚妮 周嘉黎 杨春晓 罗小梅 杨婷玉 张 玉 师少军 黄怡菲②

(华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉430022)

目的：考察RAC1基因多态性与Rac1-GTP蛋白表达水平的相关性。方法：选择182例健康汉族志愿者，经TaqMan-MGB探针等位基因分型技术测定RAC1基因中的4个标签单核苷酸多态性(tag single nucleotide polymorphism,tag-SNPs)位点的基因型，采用酶联免疫吸附法测定其血浆中的Rac1-GTP蛋白表达水平。分析Rac1-GTP蛋白表达水平的分布特点；对RAC1基因4个tag-SNPs不同基因型间Rac1-GTP蛋白表达水平进行比较。结果：Rac1-GTP蛋白表达水平在健康汉族人群中呈现正偏态分布，女性中的表达水平高于男性(P<0.05)；随着年龄的增加有降低的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。Rac1-GTP蛋白表达水平在位点rs702482和rs10951982基因型间存在显著性差异(P<0.05)，但在位点rs702483和rs6954996基因型间无统计学差异(P>0.05)。结论：在健康汉族人群中RAC1基因多态性存在影响Rac1-GTP蛋白表达水平的SNP位点。

RAC1；基因多态性；Rac1-GTP；蛋白表达水平；汉族健康人群

Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)蛋白是小G蛋白Rho超家族Rac亚家族中关键成员之一，广泛分布于各种组织，是细胞内重要的信号转导分子。Rac1在调整细胞骨架与迁移、细胞的增殖分化与凋亡、细胞转录因子的调控、肿瘤的转移与侵袭、机体免疫调节等方面发挥重要的生物学作用[1-4]。Rac1蛋白由位于人第7号染色体上的RAC1基因编码，RAC1基因的转录产物具有Rho-GTPase结合区，使Rac1蛋白具有结合和水解GTP核苷酸的能力，从而使Rac1蛋白在具有活性的GTP结合形式和无活性的GDP结合形式之间进行转换[4]。Rac1的生物学功能发挥依赖于此两种结合形式间的转换。RAC1基因序列上碱基的突变可能引起Rac1蛋白活性表达的改变。已有研究表明，Rac1蛋白活性的表达与卵巢癌、肺癌、肾功能损害、心脏功能受损、炎症性肠病等疾病的发生及发展相关[5-8]。此外，RAC1的基因多态性和Rac1蛋白活性已被证明与嘌呤类免疫抑制药的疗效和不良反应有关[9]。因此，分析RAC1基因多态性对Rac1蛋白表达的影响，有利于预测疾病的风险及药物的疗效和不良反应。

本课题组前期建立了人RAC1基因上8个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点基因型的测定方法，经过对150例湖北地区汉族健康志愿者RAC1基因上这8个SNPs的基因型分析，筛选出4个代表性的tag-SNPs(rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996)[10,11]。本研究通过建立Rac1-GTP活性蛋白表达水平的测定方法，进一步筛选健康志愿者并测定其血浆中Rac1-GTP活性蛋白表达的水平，并对Rac1-GTP活性蛋白水平和RAC1基因上的4个tag-SNPs基因型的相关性进行了分析，旨在探讨RAC1基因多态性对Rac1-GTP蛋白表达的影响，为进一步研究RAC1基因多态性与药物效应及相关疾病之间的关系奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 7900HT型荧光定量PCR仪、NanoDrop1000微量紫外分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)；EnSpire多模式微孔板检测仪(美国PerkinElmer公司)；TaqMan Genotyping Master Mix试剂盒、TaqMan SNP Genotyping Assay Mix试剂盒(含引物和探针)、热启动Taq DNA聚合酶(美国ABI公司)；人Rac1-GTP结合蛋白酶联免疫分析试剂盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，北京天根生化科技有限公司)。

1.1.2 研究对象 选取2014年2～3月期间于武汉协和医院体检中心进行体检的182例健康受试者作为研究对象，男女各半。年龄23～85岁，平均(44.7±12.1)岁，性别间年龄分布无统计学差异(P=0.33)。所有研究对象均为汉族，无血缘关系；无心、肝、肾、消化道、神经系统等病史，无肿瘤病史；体格检查、ECG、胸片、B超及实验室检查均未见临床意义的异常。该研究项目通过华中科技大学医学伦理委员会的审批。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理 采集健康受试者静脉血3 ml，经EDTA抗凝，于3 000 r/min离心10 min，取离心后的上层血浆置于-70℃以下冰箱中保存用于Rac1-GTP结合蛋白水平的测定。再将分离后的白细胞层采用DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，按照试剂盒的说明书操作。提取后的DNA经微量紫外分光光度仪进行浓度与纯度的测定，浓度均在1～20 ng/μl之间，OD260/OD280值均在1.6～2.0之间，纯度满足要求。将测定合格后的DNA置于-70℃以下冰箱中保存用于基因型分析。

1.2.2 基因型分析[11]采用实时荧光TaqMan-MGB探针等位基因分型技术对课题组前期筛选出的4个tag-SNPs(rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996)进行基因分型检测。10 μl的PCR反应体系包括：5 μl TaqMan® Genotyping Master Mix，1.0 μl TaqMan® SNP Genotyping Assay Mix，1.0 μl DNA样本，3 μl 纯化水。PCR扩增反应条件为：95℃预变性4 min，激活Ampli Taq酶；然后94 ℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共45个循环，72℃最终延伸2 min。反应结束由ABI Prism® 7900HT实时荧光PCR等位基因辨别系统(SDS v2.3 Allelic Discrimination Software)确定各DNA样本的基因分型结果。对4个tag-SNPs位点的各基因分型PCR扩增产物进行DNA测序验证。

1.2.3 Rac1-GTP结合蛋白水平测定 人血浆中Rac1-GTP结合蛋白表达水平的测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，选用人Rac1-GTP ELISA试剂盒。严格按照试剂盒使用说明书方法对稀释后的标准品及样品进行加样、温育、洗涤、加酶、显色、加终止液。终止反应后15 min内于酶标仪依序测定各孔的450 nm波长处的吸光度。人血浆样本中Rac1-GTP结合蛋白表达水平的结果由标准曲线读取。

2 结果

2.1RAC1基因分型 实时荧光TaqMan-MGB探针等位基因分型测定结果与测序结果完全一致，各tag-SNPs位点的基因分型测序验证结果，见图1。4个tag-SNPs位点基因型的分布，经χ2检验均符合Hardy-weinberg遗传平衡，性别间分布无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 各tag-SNPs位点的基因型分布

Tab.1 Genotypic distributions of 4 tag-SNPs

SNPsGenotypeTotal[n(%)]Male[n(%)]Female[n(%)]P1)P2)rs702482AA53(291)26(286)27(297)019061AT82(451)44(484)38(418)TT47(258)21(231)26(286)rs10951982GG118(648)60(659)58(637)026085GA54(297)27(297)27(297)AA10(55)4(44)6(66)rs702483AA134(736)66(725)68(747)072079AG45(247)24(264)21(231)GG3(16)1(11)2(22)rs6954996GG133(731)67(736)66(725)093073GA45(247)23(253)22(242)AA4(22)1(11)3(33)

Note：1)Hardy-Weinberg equilibrium test;2)Comparison between male and female subjects.

图1 各tag-SNPs位点基因分型测序图Fig.1 Representative figures of direct sequencing for four tag-SNPs

2.2 Rac1-GTP结合蛋白活性分布 182例健康受试者的血浆样本经ELISA法测定，Rac1-GTP结合蛋白表达水平为(222.30±108.85)ng/L，通过Kolmogorov-Smirnov正态性检验，Rac1-GTP结合蛋白表达水平呈正偏态分布(偏度=1.921，P<0.05)，见图2A；将数据进行对数转化后，符合正态分布(P=0.23)，见图2B。

将数据经对数转化后进行单因素方差分析，考察年龄和性别因素是否会影响Rac1-GTP蛋白的表达。Rac1-GTP蛋白在男、女性别间的表达分别为(199.83±88.75) ng/L和(244.76±122.20) ng/L，女性中Rac1-GTP蛋白的表达高于男性；性别间存在显著性差异(P<0.05)。将受试者按年龄分为青年组(18～40岁)、中年组(41～60岁)和老年组(≥61岁)随着年龄的增加Rac1-GTP结合蛋白的表达水平有降低的趋势，但经对数转化后的方差分析显示在三个年龄组间表达无显著性差异(P>0.05)，见表2。

图2 Rac1-GTP表达水平分布图Fig.2 Distribution of Rac1-GTP expression levelsNote:A.Data without log-transform;B.Data with log-transform.

表2 不同性别、年龄组间Rac1-GTP蛋白表达水平

Tab.2 Rac1-GTP expression levels in different gender and age groups

GroupnRac1⁃GTPlevel(ng/L)P1)Gender0003Male9119983±8875Female9124476±12220Age21-407023207±10268040641-609521770±11672≥611720772±88130

Note：1)Analysis of variance with log-transformed data.

表3 4个tag-SNPs不同基因型间Rac1-GTP蛋白表达水平

Tab.3 Rac1-GTP expression levels in different genotypes of four tag-SNPs

SNPsGenotypeRac1⁃GTPlevel(ng/L)P1)rs702482AA2650±147200037AT2114±8560TT1931±7774rs10951982GG2409±120700023GA1930±7319AA1611±5917rs702483AA2260±115906600AG2149±8806GG1690±3822rs6954996GG2299±115501300GA1974±8561AA2517±8857

Note：1)Analysis of variance with log-transformed data.

图3 RAC1基因型与Rac1-GTP表达水平相关性Fig.3 Association analysis of RAC1 genotypes with Rac1-GTP expression levelsNote: *.P<0.05；**.P<0.01；ns.P>0.05.

2.3RAC1基因型与Rac1-GTP结合蛋白活性的相关性RAC1基因4个tag-SNPs不同基因型对应的Rac1-GTP蛋白表达水平及比较，如表3和图3所示。由结果可知：Rac1-GTP蛋白表达水平在位点rs702482和rs10951982基因型间存在显著性差异(P<0.05)，在位点rs702483和rs6954996基因型间无统计学差异(P>0.05)。

3 讨论

RAC1是细胞内重要的信号转导分子，具有多种生物学功能，如调整细胞骨架与迁移、抑制细胞凋亡、调控细胞转录因子等；广泛地分布于全身各组织中[1-4]。

因具有Rho-GTPase高度亲和结合区，Rac1蛋白在体内以具有活性的GTP结合形式和无活性的GDP结合形式之间进行转换[4]，而生物功能的发挥与GTP结合时激活密切相关。Rac1由RAC1基因编码，其蛋白表达水平可因RAC1基因碱基的突变而发生改变。SNP是最普遍的一种基因突变形式，与蛋白个体化表达差异密切相关。目前关于RAC1基因多态性对Rac1蛋白表达的影响尚未见报道，而已报道的文献主要与疾病相关性及药物疗效差异有关。如已有研究发现Rac1蛋白在结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等患者中存在高表达现象[12,13]；RAC1基因的部分SNP位点对某些疾病呈现易感性，如黑色素瘤、炎症性肠疾病、高血压等[8,14,15]。此外，嘌呤类免疫抑制药因通过抑制RAC1的下游靶基因表达和阻断Rac1活性，发挥免疫抑制作用，进而RAC1基因和Rac1蛋白对嘌呤类免疫抑制药的疗效及不良反应的差异有影响[9]。本研究以健康志愿者为研究对象，选择测定Rac1-GTP活性蛋白的表达水平；以课题组前期研究基础筛选出的4个tag-SNPs作为RAC1基因多态性的位点，考察RAC1基因多态性对Rac1-GTP蛋白表达的影响，希望能找出与Rac1-GTP蛋白相关的基因多态性位点，进一步为揭示疾病和药物效应相关性的分子机制奠定基础。

本研究入选182名健康受试者，按照年龄匹配，男女各半。所筛选的4个SNP位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，表明选择的人群具有代表性；并且无性别间的分布差异(P>0.05)。4个SNP位点的基因型频率与前期研究结果及HAPMAP数据库中亚洲人群的报道相接近，但是与非洲和欧洲人群的报道有较大差异。本研究所报道的中国健康人群携带rs702482位点AA基因型的频率(29.1%)远低于欧洲人群(96.7%)，而携带rs702483位点AA基因型的频率(73.6%)远高于欧洲人群 (26.4%)。最小等位基因频率rs702482/T (48.4%)和rs10951982/A (20.3%)分别远高于欧洲(1.7%)和非洲人群(2.5%)，rs702483/G (14.0%)和rs6954996/A (14.6%)分别明显低于欧洲(49.1%)和非洲人群(23.3%)。提示RAC1基因上的这4个SNP位点的多态性存在地域或种族的差异。

完成RAC1基因上4个SNP位点基因分型测定后，进一步考察了RAC1基因编码的Rac1-GTP蛋白在182名健康受试者血浆中的表达水平。Rac1-GTP蛋白表达水平在中国健康人群中存在男低女高的趋势(P<0.05)，4个SNP位点的基因型分布未见明显差异(P>0.05)。提示可能存在其他位点的性别分布差异，进而影响Rac1-GTP蛋白表达性别差异；亦或是男女性别的生理因素差异造成的。因已有大量文献报道Rac1蛋白的表达与诸多疾病相关，进而推测Rac1-GTP蛋白表达性别差异是否会造成相关疾病发病率的性别差异，有待大样本的考察和深入的研究。虽然未观察到Rac1-GTP蛋白的表达水平在年龄分组间的差异(P>0.05)，但是依旧呈现出了随着年龄段的增加Rac1-GTP蛋白的表达水平降低的趋势，可能是由于各年龄组样本分布不均，老年组样本量较少，未能满足显著性差异的样本量统计，需要后期大样本的进一步证实。因为Rac1-GTP蛋白表达水平的差异，使用嘌呤类免疫抑制的患者对于疗效和不良反应需要关注性别和年龄因素。

通过分析4个SNP位点的基因型与Rac1-GTP蛋白表达水平的相关性，发现rs702482位点携带AA基因型人群的Rac1-GTP蛋白表达水平高于AT和TT基因型(P<0.05)；rs10951982位点携带GG基因型人群的Rac1-GTP蛋白表达水平明显高于GA和AA基因型。提示SNP位点rs702482和rs10951982的基因多态性对Rac1-GTP蛋白表达水平存在影响。

本研究仅分析了Rac1活性结合蛋白Rac1-GTP表达水平在健康人群中的分布特点，并发现了影响Rac1-GTP表达水平的RAC1基因多态性位点。已有研究表明Rac1在众多肿瘤的发生、发展进程中起着重要作用。Rac1-GTP在健康人群与肿瘤患者间的表达水平是否存在差异，差异是否会与RAC1基因多态性相关，需要开展大样本的病例对照研究进一步确定。课题组后期将扩大样本量并筛选纳入肿瘤病例患者进行对照研究，进一步的综合分析RAC1基因多态性与mRNA和Rac1蛋白表达的相关性，探究调控RAC1基因表达的机制。

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[收稿2016-03-31 修回2016-05-06]

(编辑 许四平)

Influence of RAC1 gene polymorphisms on Rac1-GTP expression levels

LIU Ya-Ni,ZHOU Jia-Li,YANG Chun-Xiao,LUO Xiao-Mei,YANG Ting-Yu,ZHANG Yu,SHI Shao-Jun,HUNAG Yi-Fei.

Department of Pharmacy,Affiliated Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

Objective:To study the association ofRAC1 gene polymorphisms with protein expression levels of Rac1-GTP.Methods:A total of 182 healthy Hans population in Hubei were recruited.The 4 tag-SNPs inRAC1 gene were genotyped by Real time TaqMan-MGB genotyping assay.And the Rac1-GTP protein levels in plasma samples from all participants were determined by enzyme linked immunosorbent assays (ELISA).The distribution characteristics of Rac1-GTP expression levels were also analyzed.Furthermore,the expression levels of Rac1-GTP were compared among different genotypes of the 4 tag-SNPs inRAC1 gene.Results:The distribution of Rac1-GTP expression levels was positive skewed in healthy Chinese Hans population.The expression levels were significantly higher in females than in males (P<0.05),and appeared in decreased trend with age,but without significant differences (P>0.05).Different expression levels of Rac1-GTP were observed in different genotypes for rs702482 and rs10951982 (P<0.05).However,no significant difference was found for rs702483 and rs6954996 (P>0.05).Conclusion:RAC1 genetic polymorphisms can potentially affect the expression levels of Rac1-GTP protein in healthy Chinese Hans population.

RAC1;Gene polymorphisms;Rac1-GTP;Protein expression levels;Healthy Chinese Hans population

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.001

①本文为国家自然科学基金(No.81273591、No.81503161)、湖北省自然科学基金(No.2009CD-B380)和中央高校基本科研业务费专项资金(No.2014-YGYL003)资助项目。

刘亚妮(1980年-)，女，硕士，副主任药师，主要从事遗传药理与药代动力学相关研究，E-mail:yani_liu@hotmail.com。

R394

A

1000-484X(2016)12-1729-05

②通讯作者，E-mail:yf_huang2012@163.com。