不同亚型的滤泡辅助性T淋巴细胞在类风湿关节炎中的临床意义

陈晓梅，李 静，张晓盈，金月波，余 迪，孙晓麟，武丽君，何 菁△，栗占国

(1. 北京大学人民医院风湿免疫科， 北京 100044； 2. 新疆维吾尔自治区人民医院风湿免疫科， 乌鲁木齐 830001)



·论著·

不同亚型的滤泡辅助性T淋巴细胞在类风湿关节炎中的临床意义

陈晓梅1,2*，李 静1*，张晓盈1，金月波1，余 迪1，孙晓麟1，武丽君2△，何 菁1△，栗占国1

(1. 北京大学人民医院风湿免疫科， 北京 100044； 2. 新疆维吾尔自治区人民医院风湿免疫科， 乌鲁木齐 830001)

目的：检测类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者外周血中滤泡辅助性T(T follicular helper, Tfh)淋巴细胞亚型以及效应型滤泡辅助性T(T follicular helper effector memory, Tfhem)细胞的表达，并探讨二者作为活动性RA患者血液标志物的价值。方法： 流式细胞术分别检测41例RA患者和32例健康受试者的外周血中Tfh(CD3+CD4+CXCR5+CD45RA-)细胞亚型 Tfh1(CXCR3+CCR6-Tfh)、Tfh2(CXCR3-CCR6-Tfh)、Tfh17(CXCR3-CCR6+Tfh)和Tfhem (CD4+CXCR5+CCR7lowPD-1high)的水平。收集入组RA患者的临床资料及实验室指标，分析上述细胞亚型表达水平与RA疾病活动和实验室指标的相关性，酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent, ELISA)检测相关血清细胞因子。结果： RA患者外周血中Tfhem细胞的表达率明显高于正常对照组(12.8%±5.7%vs. 8.7%±2.0%,P=0.001)。Tfhem细胞表达水平与RA患者疾病活动指数(disease activity score in 28 joints, DAS28)及红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)存在显著相关性(r(DAS28)=0.205,r(ESR)=0.141,P<0.05)，与抗角蛋白抗体(anti-keratin antibody,AKA)、抗核周因子(anti-perinuclear factor, APF)及IgM型类风湿因子(immunoglobulin M-rheumatoid factors，IgM-RF)、IgA、IgM及IgG等临床指标则无明显相关性。Tfh2表达水平在RA组显著高于正常对照组(3.002%±0.408%vs. 1.730%± 0.160%,P=0.013)。Tfh2-high组RA患者的IgA[(3.045±0.261)g/Lvs.(3.963±0.815) g/L，P=0.172]、IgG[(13.800±0.862)g/Lvs.(16.980±0.224) g/L，P=0.161]和IgM[(1.135±0.083)g/Lvs.(1.731±0.380) g/L，P=0.140]高于Tfh2-low组，但差异尚无统计学意义(P>0.05)。与Tfh低表达组相比，Tfh2高表达组血清中IL-4[(2.322±0.214)ng/Lvs. (3.994±0.751) ng/L,P=0.056]和IL-10[(1.898±0.105) ng/Lvs. (3.125±0.880) ng/L,P=0.140]升高，差异无统计学意义(P>0.05)。结论： Tfhem细胞的表达与RA患者病情活动有关，可能在RA的发病过程中有预警作用，并可能成为将来治疗RA的靶细胞；Tfh2及其相关细胞因子在RA患者中明显增加，可能参与了RA的发生和发展。

关节炎, 类风湿；T淋巴细胞, 辅助诱导；疾病活动指数

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种系统性自身免疫病，主要表现为慢性、侵袭性小关节炎，也可累及心脏、肺、肾等多种器官。RA的特征之一是产生多种自身抗体(如抗环瓜氨酸肽抗体)，高滴度的自身抗体是影响RA预后的不良因素之一[1]。但是，目前广泛应用于临床来评价病情活动度的相关指标，如红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)，C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)，补体系统及各种疾病活动度评分(disease activity score in 28 joints, DAS28)等,并不能完全解释患者自身抗体产生和免疫异常的原因，因此寻找特异性反映免疫学功能的指标，是临床实践中亟待解决的关键问题。

滤泡辅助性T(T follicular helper, Tfh, CD3+CD4+CXCR5+CD45RA-)细胞是T辅助(T helper, Th)细胞的亚型之一，可促进B细胞和浆细胞的分化、成熟，从而调控抗体产生。根据Tfh细胞表面趋化因子受体CCR6和CXCR3的不同，可将其分为3个亚型：Tfh1(CXCR3+CCR6-)、Tfh2(CXCR3-CCR6-)和Tfh17(CXCR3-CCR6+)，3者分别分泌干扰素(interferon, IFN)-γ，interleukin(IL)-4和IL-17，类似于传统的Th细胞[2-3]。研究显示，Tfh2和Tfh17可有效诱导幼稚B细胞分化为浆细胞，而Tfh1则无此功能[4]。在许多免疫性疾病中，如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、免疫激活的慢性乙型肝炎以及自身免疫性甲状腺病等，Tfh细胞或某些亚型的表达与这类疾病活动度以及自身抗体滴度密切相关，可望成为监控机体抗体失调反应以及病情活动度的标志物[5]，因此鉴定和识别不同亚型的Tfh细胞能更好地认识自身免疫性疾病的发病机制，对于改善免疫病治疗和预后具有重要意义。

我们前期的研究发现，RA患者血液中低表达CCR7和高表达PD-1的CXCR5+CD4+T细胞亚型表达增多，不仅与临床病情活动程度一致，还与生发中心内Tfh细胞的活化和致病抗体产生相关[6]。动物实验结果表明，上述亚型的Tfh细胞是在生发中心免疫反应之前在外周血中产生的，可视为Tfh效应记忆(T follicular helper effector memory, Tfhem)细胞。当再次遇到致病原或抗原时，Tfhem迅速分化为Tfh细胞并促进抗体的产生，因此，Tfhem反映了机体的免疫状态并参与自身免疫病的发病机制。进一步研究显示，血液中的Tfh细胞有很多亚群，本课题组已经鉴定了CCR7lowPD-1high和CCR7highPD-1low两个亚型[6]。本研究发现了活动性RA患者外周血中的Tfhem和Tfh2细胞显著升高，并进一步明确了二者在RA中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究连续纳入2014年6月至2015年5月期间在北京大学人民医院风湿免疫科住院的初治或近3个月未应用激素和慢作用抗风湿病药物(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMRADs)的RA患者41例，入选患者均符合2010年美国风湿病学会(American College of Rheumatology, ACR)/欧洲风湿病防治联合会(European League Against Rheumatism, EULAR)RA分类标准，同时纳入32例健康志愿者作为健康对照。本研究得到北京大学人民医院伦理委员会批准(2015PHB219-01)，所有参与者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 Tfhem细胞的流式检测

抽取RA患者外周血4 mL，EDTA抗凝，分离外周血单个核细胞(peripheral blood monouclear cells, PBMC)，制成1×106个/mL的0.2 mol/L PBS细胞悬液；4 ℃环境下，加入荧光标记的目的抗体AF700-CD3、PECF-594-CD4、AF-647-CXCR5、PE/Cy7-PD-1、BV421-CCR7、PECF-594-CXCR3和BV-650-CCR6，与荧光单抗进行孵育染色；4 ℃避光反应30 min，2 500 r/min，水平离心5 min，弃上清；加入0.2 mol/L PBS 5 mL吹打均匀，2 500 r/min，水平离心5 min，弃上清；以上方法再洗一次；流式细胞仪测定细胞表面荧光标记率及标记强度的变化。外周血Tfh及其亚型定义如下：Tfh：CD3+CD4+CXCR5+CD45RA-；Tfh1[3]：CXCR3+CCR6-Tfh；Tfh2[3]：CXCR3-CCR6-Tfh；Tfh17[3]：CXCR3-CCR6+Tfh；Tfhem[2]：CD3+CD4+CXCR5+CCR7lowPD-1high。

1.2.2 临床及实验室指标

收集RA患者的基本资料(年龄、性别、病程等)、疾病活动度指标(ESR、CRP等)及各种免疫学指标(抗环瓜氨酸肽抗体、类风湿因子等)。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般资料

本研究入选的RA患者为41例，男性11例，女性30例，年龄20～82岁，平均(56.1±14.0)岁，病程0.1～39.0年，平均(8.2±8.1)年。正常对照32例，男性8例，女性24例，年龄24～76岁，平均(52.3±13.2)岁。两组在年龄、性别上差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 Tfhem细胞表达在RA和正常人中的比较

应用流式细胞术检测以CD3+CD4+CXCR5+CCR7lowPD-1high为标记的Tfhem细胞在RA(n=41)及正常人(n=32)的阳性表达率。应用χ2检验比较各组数据，结果显示，Tfhem细胞在RA中的阳性率显著高于正常人(45.1%vs. 3.1%，P=0.001)。

2.3 Tfhem细胞表达与RA患者的临床和实验室指标之间的关系

如表1所示，以正常对照Tfhem的均数±2×标准差为cut-off值，将RA患者分为Tfhem-low(n=33)和Tfhem-high(n=8)两组。在RA患者中，Tfhem细胞高表达与低表达组在性别、年龄、病程上差异无统计学意义。Tfhem细胞高表达组患者的疾病活动指数DAS28评分明显升高(P=0.022)， 并伴ESR加快(P=0.013)。两组间抗角蛋白抗体(anti-keratin antibody,AKA)、抗核周因子(anti-perinuclear factor, APF)及IgM-RF(immunoglobulin M-rheumatoid factors)、IgA、IgM及IgG等差异均无统计学意义。

表1 RA患者Tfhem细胞表达水平与临床特点的相关性分析

DAS28, disease activity score in 28 joints; ESR, erythrocyte sedimentation rate; CRP, C-reactive protein; RF, rheumatoid factors; Anti-CCP, anti-cyclic citrullinated peptideantibody; AKA, antikeratin antibody; APF, antiperinuclear factor. *P<0.05.

2.4 Tfhem细胞在不同疾病活动指数(DAS28评分)的RA患者中表达水平的比较

由图1所示，RA患者外周血中Tfhem细胞的表达率为12.8%±5.7%，明显高于正常对照组8.7%±2.0%，而且病情活动度越高，Tfhem表达水平越高，差异具有统计学意义。

2.5 Tfh细胞亚型的表达及其在RA中的意义

如图2所示，与正常人相比，Tfh2亚型在RA患者外周血中的表达显著升高，而Tfh1和Tfh17在两组中的表达差异无统计学意义。

以正常对照Tfh2的95% CI为cut-off值，将RA患者分为Tfh2-low(n=35)和Tfh2-high(n=6)两组。Tfh2-high组的IgA，IgG和IgM高于Tfh2-low组，但差异尚无统计学意义(图3)。

A,peripheral blood monouclear cells (PBMC) were isolated from 41 patients with rheumatoid arthritis (RA) and 32 healthy controls (HC). Tfhem cells were analyzed by flow cytometry. The result showed that the percentages of Tfhem in RA patients was significantly increased (P=0.001). B, divided the RA patients into four groups according to the disease activity score in 28 joints (DAS28), results showed that the increased expression of Tfhem was correlated with higher DAS28. Values are the percentages of Tfhem cells in CD4T cells.

图1 Tfhem细胞在RA中的表达及其与疾病活动度的相关性

Figure1 Expressions of T follicular helper effector memory (Tfhem) cells and the correlation with disease activity

PBMC were isolated from 41 patients with RA and 32 HC. Tfh subsets were analyzed by flow cytometry.The result showed that the expression of Tfh2 cells, but not Tfh1 or Tfh17, was significantly increased in RA patients (P=0.013). Values are the percentages of each gated subset in CD4T cells.

图2 Tfh细胞亚型在RA中的表达

Figure2 Expressions of T follicular helper (Tfh) subsets in peripheral blood

为了进一步探讨Tfh细胞亚型在RA发病和发展中的意义，我们进一步检测了相关细胞因子的表达。研究显示，Tfh2具有Th2相似的体液免疫的特点，与Tfh2-low组患者相比，Tfh2-high组患者血清中IL-4[(2.322±0.214)ng/Lvs. (3.994±0.751)ng/L]和IL-10[(1.898±0.105)ng/Lvs. (3.125±0.880)ng/L)]升高，但差异无统计学意义，可能参与了Th2反应，导致了RA征抗体产生及高球蛋白血症的形成(图4)。

3 讨论

RA等自身免疫性疾病的重要发病机制之一是由于产生针对自身抗原的自身抗体而导致的组织损伤。近年来的大量研究表明，自身抗体主要产生于外周淋巴器官的生发中心(germinal center, GC)。CD4+Th细胞在GC对B细胞进行辅助，免疫球蛋白在GC发生亲和力成熟及亚型转换[2]。免疫领域的学者重新认识了一群定位于生发中心，稳定表达CXCR5，与CXCR13结合后具有滤泡归巢能力的CD4+T细胞，称为Tfh。Tfh细胞能在GC直接辅助B细胞，选择高亲和力的B细胞分化为记忆细胞或浆细胞，并维持体液免疫应答[3]。关于人类疾病的研究中，Choi等[7]发现，SLE患者外周循环中表达CD4+CXCR5+PD-1+或CD4+CXCR5+ICOS+的细胞比例增高，且与包括抗dsDNA抗体在内的自身抗体滴度及肾的终末脏器损伤有关，而与病程、治疗用药及病情活动度无关。免疫激活的慢性乙型肝炎患者的研究也发现外周血CD4+CXCR5+T细胞比例较非活动性乙型肝炎及健康对照增高，且其比例与血清谷丙转氨酶呈正相关[8]。自身免疫性甲状腺病患者外周血CD4+CXCR5+PD-1+及CD4+CXCR5+ICOS+T细胞比例也增高，并与抗甲状腺抗体水平正相关[9]。上述研究提示，Tfh细胞在自身免疫病患者外周血中比例增高，并且可能与自身抗体的产生相关。

Divided the RA patients into Tfh2-low (n=35) and high (n=6) groups according to the 95% CI value of Tfh in heathy controls. The disease activity indicators such as DAS28 (A), erythrocyte sedimentation rate (ESR, B), C-reactive protein (CRP, C), as well as the immunological indicators, like serm levels of anti-cyclic citrullinated peptide (CCP, D) antibodies, rheumatoid factors (RF, E), γ-globulin (F), IgM (G), IgG (H), IgA (I), were no significant difference between the two groups. Values are the concentrations of each clinical indicators in serm.

图3 Tfh2细胞亚型与RA患者临床指标的相关性

Figure3 Correlations between Tfh2 and clinical indicators in RA

本课题组前期利用流式细胞术的方法定义了Tfhem细胞，是表型以CXCR5+CCR7lowPD-1high为特征的CD4+T细胞，而前期Tfh已被证明具有异质性，而且包含Th1，Th2和Th17相关细胞因子的特殊亚型[9]，然而，Tfh细胞亚群在RA发病中的作用尚不清楚。本研究发现，RA患者在疾病活动期Tfhem细胞高表达，与现有的疾病活动度有极强的相关性，而且可以直接反映体内的免疫细胞失衡状态，对于治疗及疗效的监测有极高的指导意义。另外，Tfh2亚型在RA中明显高于正常对照，Th2相关的细胞因子IL-4也有升高的趋势，可能参与了Tfh病理状态中的分化。然而，尚无实验依据证明特异的致病性自身抗体参与RA的病理过程，而Tfhem是活跃的辅助B细胞产生抗体的亚型，并且Tfh2的升高也与体液免疫相关。在RA的发病过程中，循环中Tfh细胞出现明显的分化异常，而血清IL-4，-10等细胞因子的升高同时参与Tfh细胞分化的正反馈。本研究结果显示Tfhem、Tfh2低表达的RA患者与高表达的RA患者在自身抗体及免疫球蛋白水平差异无统计学意义，由此我们认为外周血中的Tfh可能不能完全反映生发中心的Tfh细胞功能，所以需要进一步进行动物免疫实验检测生发中心的Tfh细胞亚型，以明确抗体产生的功能。

综上所述，Tfhem细胞在临床上可反映RA患者的疾病活动状态，在疾病的免疫机制中也可以与临床一致性地反映免疫细胞中效应细胞活化的状态，因此很有可能进一步地促进疾病的发展，解释患者自身抗体产生和免疫异常的原因，可以看做是RA病情进展的预警信号。我们同时发现Tfh2细胞和相关的细胞因子在RA中升高，可能参与了RA相关病理性T细胞的分化。本研究尚存在不足之处，样本量较小，需扩大病例数，进行多中心的研究和鉴定，以进一步明确Tfhem细胞在RA中的临床意义。此外，本研究缺少用药后Tfhem及Tfh2细胞表达水平的变化及不同治疗药物对其表达的影响的研究数据，需进一步完善。

RA patients were divided into Tfh2-low (n=34) and high (n=4) groups, and three were no significantdifference between Tfh2 cells and serum levels of IL-2 (A), 4 (B), 6 (C), and 10 (D). Values are the concentrations of each cytokines in serum.

图4 Tfh2细胞与血清细胞因子的相关性

Figure4 Correlations between Tfh2 cells andserum cytokines

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(2016-08-11收稿)

(本文编辑：刘淑萍)

Significance of different T follicular helper subsets in rheumatoid arthritis

CHEN Xiao-mei1,2*, LI Jing1*, ZHANG Xiao-ying1, JIN Yue-bo1, YU Di1, SUN Xiao-lin1,WU Li-jun2△, HE Jing1△, LI Zhan-guo1

(1. Department of Rheumatology and Immunology, Peking University People’s Hospital, Beijing, 100044, China; 2. Department of Rheumatology and Immunology, The People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi, 830001, China)

Objective： To detect the expressions of T follicular helper (Tfh) subsets and T follicular helper effect memory (Tfhem) cells in circulation of patients with rheumatoid arthritis (RA), as well as to examine their roles in providing biomarkers for active RA. Methods: This study enrolled 41 patients with RA, who were naïvely-treated or had no application of hormone and disease-modifying anti-rheumatic drugs in recent 3 months, as well as 32 healthy controls. The percentages of Tfhem (CD4+CXCR5+CCR7lowPD1high) cells, Tfh (CD3+CD4+CXCR5+CD45RA-) subsets, Tfh1 (CXCR3+CCR6-Tfh)，Tfh2 (CXCR3-CCR6-Tfh)，and Tfh17 (CXCR3-CCR6+Tfh), were determined by flow cytometry of peripheral blood from the patients with RA and health controls. Serum levels of cytokines were detected by enzyme-linked immunosorbent (ELISA). The correlations of Tfhem/Tfh subsets with clinical indicators were analyzed. Results: The mean age of the patients was (56.1±14.0) years (range: 20-82 years), the mean disease duration was (8.2±8.1) years. There was no significant difference between the RA patients and the health controls with age and gender. As compared with the health control, the percentage of Tfhem was significantly increased in the peripheral blood of the RA patients (12.8%±5.7%vs. 8.7%±2.0%,P=0.001). Moreover, the increased Tfhem was correlated with the higher disease activity score in 28 joints (DAS28) and erythrocyte sedimentation rate (ESR), but not with other clinical indicators, such as C-reactive protein (CRP), anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) antibodies, and rheumatoid factors (RF). In addition, the percentage of Tfh2 subset, but not Tfh1 or Tfh17, was significantly increased in the RA patients (3.002%±0.408%vs. 1.730%±0.160%,P=0.013). As compared with Tfh2-low group, serum levels of Ig (immunoglobulin) A [(3.045±0.261) g/Lvs.(3.963±0.815) g/L,P=0.172], IgG [(13.800±0.862) g/Lvs.(16.980±0.224) g/L,P=0.161], IgM [(1.135±0.083) g/Lvs.(1.731±0.380) g/L,P=0.140], IL (interleukin)-4 [(2.322±0.214) ng/Lvs.(3.994±0.751) ng/L,P=0.056] and IL-10[(1.898±0.105) ng/Lvs. (3.125±0.880) ng/L,P=0.140] in Tfh2-high group tended to increase with no significant statistical difference. Conclusion: Our data suggest that Tfhem is associated with disease activity and is a va-luable marker for active RA. It also presents a potential pathogenesis in the development of RA and the target for future therapies. Meanwhile, the increased Tfh2 and associated cytokines might be involved in the development of RA.

Arthritis, rheumatoid; T-lymphocytes, helper-inducer; Disease activity score

国家自然科学基金(81373117, 81429003)资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (81373117,

时间：2016-10-31 16：04：17

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161031.1604.002.html

R593.22

A

1671-167X(2016)06-0958-06

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.007

81429003)

△ Corresponding author’s e-mail, wwlj330@126.com,hejing1105@126.com

*These authors contributed equally to this work