复方葛根片对衰老大鼠胸主动脉损伤的保护作用

李允江 ，孙琳 ，毕云生 ， 张淑瑜，于燕莉*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250035；2.济南军区总医院药剂科，山东 济南 250031)



【药理与毒理】

复方葛根片对衰老大鼠胸主动脉损伤的保护作用

李允江1，孙琳1，毕云生2， 张淑瑜2，于燕莉2*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250035；2.济南军区总医院药剂科，山东 济南 250031)

为研究复方葛根片对D-半乳糖致大鼠衰老后血清中同型半胱氨酸(Hcy)水平的影响及胸主动脉损伤的保护作用，将大鼠分为模型组，正常组，复方葛根片高、中、低剂量组。采用皮下注射D-半乳糖的方法制备大鼠衰老模型，运用AU5800全自动生化仪测定血清中Hcy的含量，运用SPSS16分析各Hcy含量和体重差异。对大鼠胸主动脉进行HE染色，在光镜下观察血管的组织病理学病变。研究结果表明，模型组与正常组以及各给药组与模型组的Hcy水平、体重均存在显著性差异(P<0.01))。复方葛根片各剂量组对胸主动脉血管具有不同程度的保护作用，高剂量组的保护作用最明显。 研究认为复方葛根片能降低D-半乳糖致衰老大鼠血清中Hcy水平，并对胸主动脉的血管损伤具有保护作用。

D-半乳糖 ；同型半胱氨酸；老龄鼠

根据2011年中国第六次人口普查结果预计，至2037年我国老龄化人口将突破4亿[1]。心脑血管疾病是威胁老年人口健康的重要疾病之一，在造成老年人死亡的疾病中占首位。Ungvari等[2]发现65～74 周岁的老年人中，因心脑血管疾病死亡的人数占总死亡人数的 40%；而在年龄大于等于 85 岁的人群中，这一比例升至约 60%。Wald等[3]研究发现血浆中的同型半胱氨酸(Hcy)含量与心血管疾病的发生成正相关，还有很多学者的研究结果都证实了Hcy是独立的心脑血管疾病风险的预测因子。

D-半乳糖衰老动物模型是一种比较成熟的衰老动物模型，该造模方法相比于其他几种衰老模型得到的结果更加稳定。秦红兵等[4]研究发现D-半乳糖建立亚急性衰老模型可使小鼠记忆功能下降、氧自由基产物增加、抗氧化能力和免疫功能降低，认为此模型可用于行为学、抗氧化以及免疫等方面的抗衰老药效研究。本课题组的前期研究也已经显示，D-半乳糖能够升高衰老大鼠血清中Hcy的水平。课题组前期的实验结果表明复方葛根片(济南军区总医院的院内制剂)具有良好的抗衰老作用，但其对血管的作用尚未见报道。本实验将采用D-半乳糖诱导的大鼠衰老模型，研究复方葛根片对胸主动脉损伤以及血清Hcy水平的影响，以期揭示其抗衰老作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

无特定病原体级实验用雄性Wistar大鼠50只，体重160～180 g，购自山东大学实验动物中心(许可证号SCXK(鲁)2013-0009)，饲养在济南军区总医院实验动物中心。

1.2 仪器及试药

精密电子天平(JA3003)，上海精科仪器公司；医用低速离心机(B600A)，北京白洋医用离心机有限公司；D-半乳糖(15121101)，张家港市思普生化有限公司；全自动生化分析仪(AU5800)，美国贝克曼库尔特公司；水合氯醛(10%，批号：20151023)，济南军区总医院制剂室；复方葛根片(0.4 克/片，相等于含生药材0.3 g，批号：20151026)，济南军区总医院制剂室，多聚甲醛溶液(自配);Tissue-TEK全自动组织脱水机，德国MEDITE公司; Tissue-TEK全自动染色机，德国MEDITE公司；Hcy测定试剂盒(批号：2016040016)，浙江东瓯诊断产品有限公司。

2 方法

2.1 分组及给药

Wistar大鼠按体重随机分成5个组，即正常组、模型组、复方葛根片高剂量组(简称高剂量组)、复方葛根片中剂量组(简称中剂量组)和复方葛根片低剂量组(简称低剂量组)，每组10只。每组每天正常喂食、喂水；模型组、高剂量组、中剂量组和低剂量组每天定时腹腔注射D-半乳糖150 mg/kg，正常组注射同样体积的生理盐水，按照体重每100 g注射1 mL的量进行操作。根据药理实验方法学中的折算系数(0.018)确定灌胃剂量，高剂量组、中剂量组和低剂量组按照和人的等效剂量(中剂量)2.26 g/d用灌胃器每天定时灌胃给药，灌胃前对大鼠禁食禁水2 h，确保空腹给药。正常组根据各大鼠体重按照每100 g注射1 mL的剂量进行蒸馏水灌胃。以周为单位测量各组体重，根据体重对相应的给药剂量进行调整。直至给药7周后结束。

2.2 指标的检测

给药全部结束后，禁食不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛，用5 mL真空采血管经腹主静脉取血，轻微晃动使充分混合后静置片刻于低温离心机中3 000 r/min离心分离血清，并置于eppendoff管中，保存在-80 ℃的超低温冰箱中备用。取血后快速剪下胸主动脉，用生理盐水洗去残留的血液。用眼科手术剪去除血管外围的脂肪组织，然后用足量的多聚甲醛溶液进行固定并保存。取200 μL血清(足量)，置于全自动生化分析仪中检测Hcy的含量；用全自动脱水机对血管组织进行脱水，固定包埋，进而用全自动染色机进行HE染色。显微镜下观察血管的组织病理切片，分析药物对大鼠胸主动脉的影响。

2.3 统计方法学

用统计学软件SPSS16对大鼠血清中Hcy的水平、体重进行单因素方差分析，表格数据按照x±s的形式表示，比较各组Hcy水平、体重的差异，按照P<0.05的标准定义差异是否显著。

3 结果

3.1 大鼠一般情况差异性

正常组大鼠毛色顺滑白亮，精神矍铄；模型组精神萎靡，毛色粗糙，呈现出轻微的黄色，脊背高高弯起。各给药组精神状态良好，但毛色不是特别白净光滑，给药组之间精神状态差异不显著。各组给药前的体重均无显著性差异(P>0.01)，提示随机分组成功；各给药组大鼠体重用药后比用药前均显著增加(P<0.01)，但体重增加量正常组大于高剂量组大于中剂量组大于低剂量组大于模型组。用药后正常组体重与模型组相比显著提高，有统计学意义(P<0.01)；复方葛根片各给药组与模型组相比，大鼠体重显著提高，有统计学意义(P<0.01)。体重结果提示D-半乳糖能降低大鼠体重增长的速度，复方葛根片能降低D-半乳糖对大鼠体重增长的抑制作用。结果见表1。

表1 各组大鼠用药前后体重的差异(x±s)Table 1 Body weight differences of rats before and after drugs

3.2 大鼠血清Hcy的水平

经SPSS分析，Hcy水平的方差不齐(P=0.048<0.05)。模型组与对照相比，Hcy水平显著升高，有统计学意义(P<0.01)，提示模型制作成功；高、中、低3个剂量组与模型组相比，Hcy水平均显著降低，有统计学意义(P<0.01)，提示复方葛根片能明显降低衰老大鼠血清中Hcy的水平。但各给药组与正常组相比均有显著性差异(P<0.01)，说明高、中、低3剂量组均不能使Hcy水平降至正常水平。结果见表2。

表2 各组大鼠Hcy的水平(x±s)Table 2 Hcy level of each rat group (x±s)

3.3 大鼠胸主动脉血管组织病理学检测结果

如图1所示，模型组的胸主动脉在镜下可以发现血管管腔不规则，局部血管内膜水肿并伴有炎细胞浸润，局部内皮细胞肿胀，内膜增厚，局部内皮细胞脱失，血管组织及平滑肌增生。正常组血管管腔规则，内皮细胞未见肿胀，内膜光滑，未见脂质沉淀，血管内膜、中膜以及血管壁未见纤维组织及平滑肌增生，无炎性细胞浸润。低剂量组血管管腔不规则，管腔内轻度浸润，血管内皮细胞虽未脱落但出现水肿，血管内膜及血管壁无明显水肿及炎性细胞浸润。中剂量组的动脉血管未见明显狭窄，内膜及管壁未见水肿及增生肥厚，无脂质沉淀，局部内皮细胞轻度水肿。高剂量组血管管腔较规则，内皮细胞未见水肿，血管内膜无脂质沉淀，血管壁未见明显纤维组织及平滑肌增生，无炎性细胞浸润。

图1 大鼠胸主动脉血管组织病理学检测结果(×100，HE)Fig.1 Histopathological examination results of rat thoracic aorta (×100, HE)

4 讨论

心脑血管疾病是我国死亡率最高的疾病，在老年人中表现的最为突出，并且目前增长速度依然很快。同时，心脑血管疾病多是从血管病变上开始，所以有效防治血管老化对于预防和治疗心脑血管疾病具有重要意义。

Vigen等[5]研究发现血管功能障碍与衰老相关疾病的关系密切。从血管入手研究延缓衰老是一种捷径。Hcy是人体生命活动代谢的正常产物，当人们食用含蛋氨酸的蛋白质后，就会通过体内的蛋氨酸代谢途径生成，是谷胱甘肽以及S-AMe生成的中间产物。其中S-AME是人体内良好的甲基供体，是一种不可或缺的生命物质，能够保证体内的生化反应按照正确而有效的方式进行。也就是说食用的蛋氨酸先转换为同型半胱氨酸，再经过一系列的生化反应转化为谷胱甘肽和S-AMe。但是一旦机体由于种种原因而缺乏维生素B族的一些元素、叶酸，以及个别金属元素比如锌等，就会使生化反应的某些环节因缺少反应物而无法完成正常的转化过程，同型半胱氨酸的利用减少，会使体内同型半胱氨酸含量升高，而生成谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的途径受阻，二者在体内的含量因此而降低。鲍溪荷等[6]研究发现甲钴胺可能通过降低循环 Hcy 水平降低 T2DM患者尿 MCP-1、TGF-β1 排泄，进而减轻肾脏局部增强的炎症反应。杨安宁等[7]研究发现Hcy可能影响了甲硫氨酸循环中 DNMTs 的活性，导致 AS相关基因发生 DNA 甲基化改变，进而引起泡沫细胞形成过程中胆固醇代谢紊乱。Boushey等[8]发现人体内的Hcy水平每升高5 μmol/L,患冠心病的风险将会增高70%,患脑血管病的风险也会增高50%，可见高Hcy水平的危险性非常高。孙卫华等[9]研究发现降低 Hcy浓度有益于延缓糖尿病微血管并发症的发生和发展。目前，常用叶酸、维生素B12、维生素B6以及含其有效成分的药物降低Hcy水平。然而叶酸虽可通过降低Hcy的水平来减少发生心脑血管疾病的可能性，但是一旦病人患有了心脑血管疾病，服用叶酸却不能治愈疾病。Loscalzo[10]研究发现Hcy可通过介导血管平滑肌细胞的增殖以及基质形成,从而产生有害作用。付伟光等[11]研究发现动态监测冠心病患者 Hcy等水平的变化，有助于了解冠心病病程发展，预测冠心病病变的严重程度，指导临床合理用药。Xu 等[12]在用一定浓度的同型半胱氨酸诱导血管内皮细胞衰老的实验过程中，发现细胞内粘附分子1 以及PAI-1 在血管内产生，而这两种物质是动脉血管发生病变的初始物质，说明Hcy能够诱导这两种物质的产生和释放，能够诱导血管的动脉硬化的发生。Jia等[13]研究发现在糖尿病血管病并发症中，Hcy可损伤血管内皮结构，从而影响血管的功能。于燕莉等[14]研究发现复方葛根片能够降低D-半乳糖致衰老大鼠模型引起的氧化应激反应，而Gonzalez等[15]研究发现氧化应激反应能够诱导胰岛素受体信号通路，从而降低衰老器官的自噬反应。而自噬反应可以清除体内在蛋白质合成过程中产生的错误蛋白等物质，起到保护血管的作用。这可能是复方葛根片延缓衰老的一条作用途径，但具体机制和其他作用途径还有待进一步研究。

本实验研究发现复方葛根片能够降低衰老大鼠Hcy的水平，并且呈现出了一定的量效关系，血管的组织病理切片显示复方葛根片对血管的结构具有一定的保护作用。Loscalzo[10]认为叶酸降低Hcy具有剂量依赖性，其促进血管平滑肌细胞增殖以及基质的形成从而对血管具有一定的损害作用。所以，复方葛根片在这方面与叶酸相比具有有一定的优势。

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Protective effect of compound puerarin tablet on thoracic aorta injury of aged rats

LI Yun-jiang1，SUN Lin1，BI Yun-sheng2，ZHANG Shu-yu2，YU Yan-li2*

(1.School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Department of Pharmacy, General Hospital of Jinan Military Command, Jinan 250031, China)

∶We divided rats into model group and normal group, and high, middle and low dose group of compound puerarin tablet to investigate the impact of compound puerarin tablet on D-galactose induced serum homocysteine (Hcy) level and protective effect on thoracic aorta injury of aged rats. We employed subcutaneous D-galactose injection to establish rats aging model, AU5800 automatic biochemical analyzer to detect Hcy content in rats serum, and SPSS16 to analyze Hcy content and weight difference of each group. We also performed HE staining to rats thoracic aorta and observed its pathological changes with a light microscope. Results show that significant difference (P<0.01) exists in Hcy level and weight of model group and normal group, each dose group and model group. Different dose groups have different protective effects on thoracic aortic vessels, especially for the high dose group having best protective effect. We discover that compound puerarin tablets can reduce Hcy levels in D-galactose induced old rats serum and have protective effects on vascular injury of thoracic aorta.

∶ D-galactose; Homocysteine; aged rat

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.010

2016-06-27

李允江(1990—)，硕士研究生，研究方向为药理学。Email:291484173@qq.com

*通信作者，于燕莉，主任药师。Email：yuyanli323@sohu.com

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