紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析

陈 敏，马 琳，贾聪俊，刘希强，龚 攀，王 赞

(中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析

陈 敏，马 琳，贾聪俊，刘希强，龚 攀，王 赞*

(中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

赤霉素受体(GID)是赤霉素信号转导途径的重要成员，直接影响着赤霉素对植物体效应的发挥。该研究利用同源克隆的方法，首次从紫花苜蓿中克隆得到1个赤霉素受体基因，命名为MsGID1b。序列分析发现，MsGID1b基因开放阅读框长度为1 053 bp，编码350个氨基酸，推测其蛋白质分子量为39. 839 kD，是一个无信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白。序列比对结果表明，MsGID1b基因与蒺藜苜蓿MtGID1b基因的核苷酸序列相似性为98%，氨基酸序列相似性为99%，且具有HSL家族典型的HGG和GXSXG保守结构域及GA、DELLA蛋白结合位点。荧光定量PCR分析表明，MsGID1b基因在紫花苜蓿各组织中的表达丰度依次为：根>盛花>初花>茎>叶>荚果；经GA3、ABA、NaCl、PEG和黑暗诱导后该基因表达上调，尤其是在GA3诱导下，MsGID1b基因的表达量一直维持在较高水平，表明MsGID1b基因可能参与紫花苜蓿的抗逆调控。

紫花苜蓿；GID1b；同源克隆；表达模式

赤霉素(GAs)是一类重要的植物激素，影响着植物生长发育的多个环节，包括种子萌发，茎杆伸长，叶片扩张，花粉成熟和开花诱导等，同时参与植物对外界环境的响应[1]。与其他植物激素相比，GAs刺激茎杆节间伸长的效果较生长素更为显著，且在促进植物生长和提高作物产量等方面不存在超最适浓度的抑制作用[2]。多项研究证明，在果实生长发育中，GA能协同其他激素共同调节果实的生长[3]。水稻和小麦“绿色革命”中的相关基因均与赤霉素相关[4-5]，各物种的赤霉素缺失突变体都具有显著的矮化表型[6]，而赤霉素缺失及不敏感突变体的深入研究则较好地解析了植物中的赤霉素信号转导途径。在植物缺少游离赤霉素的情况下，转录抑制因子DELLA蛋白大量积累在植物细胞核中，抑制下游基因的表达；而在活性赤霉素存在的条件下，赤霉素受体蛋白GID1感知并结合游离GAs，诱导下游DELLA蛋白与其形成三元复合体，进而被泛素E3酶复合体识别，最终DELLA蛋白被26S蛋白酶体降解，从而释放下游基因的表达，使植株恢复生理功能[7-9]。

赤霉素受体蛋白GID1的首次分离由UEGUCHI-TANAKA M等[10]于2005年在水稻中完成，随后，NAKAJIMA M等[11]从拟南芥中克隆得到AtGID1A、AtGID1B和AtGID1C等3个赤霉素受体基因，它们与水稻中的GID1基因具有高度的相似性，互补实验证实AtGID1s可恢复水稻gid1-1的矮化表型。随着赤霉素受体的分离，赤霉素信号转导途径得到了更好的解析[12]。目前，赤霉素受体基因已相继从杨树[13]、棉花[14]、茶树[15]、甘蓝型油菜[16]、板栗[17]、苹果[18]、葡萄[19]、花生[20]、东方山羊豆[21]等物种中成功分离和表达。李晓晨等[22]克隆了甘蓝型油菜赤霉素受体基因BnGID1，并在甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1中过量表达，得到的转基因植株高出对照49.05 cm，较大程度地恢复了NDF-1的株高。CAO等[23]将辣椒赤霉素受体基因CaGIDlb.1、CaGIDIb.2、CaGID1c在拟南芥双突变体gid1agid1c中过表达，发现过表达CaGID1s能促进茎的伸长，使植株高度增加。MAURIAT M等[13]在杨树中过表达赤霉素受体基因PttGID1，得到的转基因植株比对照植株高，且转基因植株叶片比对照组细长。李俊[24]将东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID在拟南芥中进行过表达，发现转基因植株生长速度加快，干重比对照提高90%～160%；GoGID过表达紫花苜蓿后，转基因株系的高度、干鲜重明显高于对照组，其中株高比对照提高 19%～35%，干重比对照提高 8%～46%；此外，过表达GoGID的转基因烟草植株在生物量上得到明显的提高[21]。以上实验结果表明，过表达赤霉素受体基因能够加快植株增长速度、恢复株高、提高生物量。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一种多年生优质豆科牧草，因其营养价值高，粗蛋白、维生素和矿物质含量丰富，素有“牧草之王”的美誉，提高其产量和品质一直是紫花苜蓿育种的主要目标。然而，紫花苜蓿为同源四倍体(2n=4x=32)，其异花授粉及自交不亲和的特性，使得QTL-图位克隆定位基因较为困难。近年来，紫花苜蓿遗传转化体系逐渐构建成功，为紫花苜蓿转基因育种提供了良好的技术支撑[25]。本研究利用同源克隆的方法克隆得到紫花苜蓿赤霉素受体基因，并对该基因编码蛋白的理化特性、组织表达特异性及不同处理下该基因的表达模式变化进行了分析，为该基因后续的功能验证及培育高产紫花苜蓿品种提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 植物材料

紫花苜蓿品种‘中苜1号’(MedicagosativaL. cv. Zhongmu No.1)由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所杨青川研究员惠赠。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 参照Quick RNA Isolation Kit说明书(北京华越洋生物技术有限公司)提取总RNA；参照SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)反转录体系合成cDNA。

1.2.2MsGID1b基因克隆 根据蒺藜苜蓿GID1b(GenBank登录号BN001192.1)的基因序列，利用同源克隆方法，设计特异性引物MsGID1b-F和MsGID1b-R(表1)，以‘中苜1号’cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为10 μL，ExTaq0.1 μL， 10×ExTaqBuffer 1 μL，dNTP Mixture 0.8 μL，引物各0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 5.1 μL。反应程序为94℃ 预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min 15 s，35个循环，72 ℃ 延伸10 min。1% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收PCR产物，将回收的PCR产物连接pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，再将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)，挑取单克隆进行菌液PCR检测后，阳性克隆送上海英潍捷基有限公司测序。

表1 试验中所用引物序列

1.2.3 MsGID1b理化性质及系统进化分析 采用DNAStar程序分析MsGID1b基因编码蛋白的氨基酸组成、分子量及等电点等理化性质。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析预测跨膜结构，SignalP-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)进行信号肽预测，SOPMA分析软件预测MsGID1b氨基酸序列的二级结构，ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析预测MsGID1b的亲疏水性，PSORT Ⅱ 蛋白质亚细胞定位服务器(http://psort.hgc.jp/form.html)预测该蛋白在细胞中的定位。

用BlastP对MsGID1b蛋白序列进行检索分析，检索该蛋白在其他物种中的同源序列，DNAMAN程序进行多序列比对分析，应用MEGA7通过邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。

1.2.4MsGID1b基因组织表达特异性分析 用Quick RNA Isolation Kit(北京华越洋生物技术有限公司)分别提取‘中苜1号’的根、茎、叶、初花期花朵(初花)、盛花期花朵(盛花)和荚果的总RNA，反转录为cDNA后，将cDNA稀释至5 ng/μL用于Real-time PCR。根据得到的MsGID1bORF序列设计特异性引物qMsGID1b-F1和qMsGID1b-R1(表1)，以紫花苜蓿β-actin基因作为内参基因，用ABI 7500 Real-time PCR System(ABI公司)，参照SYBRPremixExTaq(TaKaRa公司)使用说明书，采用两步法进行PCR扩增，反应程序如下：第一步：95 ℃ 预变性2 min；第二步：95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。每个组织进行3个生物学重复，每个样品进行2个技术重复。采用LIVAK K J等[26]的2-ΔΔCt方法分别计算MsGID1b在各组织中的表达量，绘制柱状图。

1.2.5MsGID1b基因在不同处理下的表达分析 将‘中苜1号’种子平铺于有滤纸的培养皿中，用无菌水将滤纸浸湿后，在光照培养箱中培养至种子发芽(24 ℃，16 h光照，8 h黑暗)，将发芽的种子移至1/2MS营养液中培养25 d后，一部分幼苗分别用0.3 mol·L-1NaCl、15% PEG、0.1×10-3mol·L-1GA3和0.1×10-3mol·L-1ABA处理2、4、8、12和24 h，一部分幼苗黑暗处理12、24、48、72 h。 用Quick RNA Isolation Kit(北京华越洋生物技术有限公司)提取处理后的植株叶片的RNA，反转录为cDNA。同1.2.4中的方法进行Real-time PCR和数据分析。

2 结果与分析

2.1 目的基因的获得及生物信息学分析

PCR扩增得到1 285 bp的目的片段(图1)，通过SnapGene软件分析测序结果可知，该片段含有一个1 053 bp的开放阅读框(图2)。使用BlastN工具对该序列进行检索，结果表明，该序列与蒺藜苜蓿MtGID1b、东方山羊豆GoGID和花生AhGID1核苷酸序列的相似性分别为98%、80%和76%，证实了该序列为紫花苜蓿的GID基因，且该基因在物种间进化相对保守，故将其命名为MsGID1b。

对MsGID1b编码的蛋白进行理化性质分析，发现该蛋白包含350个氨基酸残基，分子量为39.839

M. DL2000；1. PCR扩增产物图1 紫花苜蓿MsGID1b基因PCR扩增结果M. DL2000；1. PCR amplified productFig.1 PCR amplified products of MsGID1b

kD，其中碱性氨基酸(K、R)43个，酸性氨基酸(D、E)44个，疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)124个，极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)86个，其蛋白等电点为7.01。TMHMM跨膜结构预测结果表明，该蛋白不存在跨膜结构(图3)，由此推测该蛋白为非跨膜蛋白。SignalP-4.1Server信号肽预测结果表明，MsGID1b无信号肽(图4)。SOPMA预测结果表明，MsGID1b氨基酸序列的二级结构含有33.43% α-螺旋，10% β-转角，21.71%的延伸链和34.86%的无规则卷曲(图5)。ProtParam预测结果表明，该蛋白的不稳定系数为49.25，为不稳定蛋白，总平均亲水性值为-0.336，故推测其为亲水性蛋白。

下划线表示翻译起始位点；* 表示终止密码子图2 紫花苜蓿MsGID1b基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列Underline indicates translation initiation site; * indicates termination codonFig.2 cDNA sequence and induced amino acid sequence of MsGID1b

图3 MsGID1b跨膜结构分析Fig.3 Transmembrane structure analysis of MsGID1b

图4 MsGID1b信号肽预测Fig.4 Prediction of signal peptide of MsGID1b

蓝色.α螺旋；红色.延伸链；绿色.β转角；橙色.无规则卷曲图5 MsGID1b蛋白二级结构预测Blue. Alpha helix; Red. Extended strand; Green. Beta turn; Orange. Random coilFig.5 Prediction of secondary structure of MsGID1b

PSORTⅡ蛋白质亚细胞定位服务器预测MsGID1b定位于细胞质、微体和线粒体的可能性依次为45%、40.2%和10%。可能是因细胞质为产生GAs的场所，而微体中含有大量合成GAs的氧化酶[27]。

利用BlastP进行保守区预测和功能结构域分析发现，该蛋白属于α/β折叠水解酶超家族，与蒺藜苜蓿、大豆和花生氨基酸序列的相似性分别为99%、85%和82%。DNAMAN程序对MsGID1b及其他物种中的赤霉素受体同源蛋白进行序列比对发现，该蛋白与其他物种中的赤霉素受体蛋白含有大量同源氨基酸序列，且含有HGG、GXSXG保守结构域以及与GA、DELLA蛋白的结合作用位点(图6)。利用MEGA7软件邻接法构建MsGID1b与其他直系同源蛋白的系统发育树(图7)，结果表明，该发育树大致分为两大分支，单子叶植物水稻、小麦、大麦、玉米、高粱为一支，双子叶植物拟南芥、苹果、花生、东方山羊豆、鹰嘴豆、大豆、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿为一支， MsGID1b与双子叶豆科植物赤霉素受体蛋白同属一支，其中，与蒺藜苜蓿MtGID1b亲缘关系最近。

MtGID1b. 蒺藜苜蓿(CAP64325.1)；AhGID1. 花生(AIY56606.1)；CaGID1B. 鹰嘴豆(XP_004493628.1)；GoGID. 东方山羊豆(ADO22685.1)；GmGID1B. 大豆(XP_003518940.1)；OsGID1. 水稻(XP_015639961.1)；AtGID1B. 拟南芥(NP_191860.1)；阴影表示同源氨基酸残基；方框表示与GA或DELLA蛋白的结合位点；三角形标注表示HGG和GXSXG结构域图6 MsGID1b与其他物种GID蛋白氨基酸序列比对MtGID1b. Medicago truncatula(CAP64325.1)；AhGID1. Arachis hypogaea(AIY56606.1)；CaGID1B. Cicer arietinum(XP_004493628.1)；GoGID. Galega orientalis(ADO22685.1)；GmGID1B. Glycine max(XP_003518940.1)；OsGID1. Oryza sativa Japonica Group(XP_015639961.1)；AtGID1B. Arabidopsis thaliana(NP_191860.1)；The homologous amino acid residues were indicated with shadow; Black frame contains binding sites of GA and DELLA protein; HGG and GXSXG conserved domains were indicated with triangle frameFig.6 Amino acid sequence alignment of MsGID1b with other related GID proteins

2.2 MsGID1b基因的组织表达特异性

通过实时荧光定量PCR所得Ct值计算MsGID1b在各组织的表达量。结果表明，MsGID1b在根、茎、叶、初花、盛花和荚果中均有表达。其中，根中表达量最高，花中的表达量次之，荚果中表达量最低(图8，A)。这与拟南芥AtGID1B在各组织的表达模式相似[11]，由此可推测，MsGID1b对紫花苜蓿各个组织的生长发育均发挥作用，尤其是对根和花的生长发育有重要影响。

节点上的数值代表自举值；标尺上的数字代表遗传距离MtGID1b. 蒺藜苜蓿(CAP64325.1)；CaGID1B. 鹰嘴豆(XP_004493628.1)； GmGID1B. 大豆(XP_003518940.1)；GoGID. 东方山羊豆(ADO22685.1)；AhGID1. 花生(AIY56606.1)；MdGID1b.苹果(AFD32891.1)；MdGID1c. 苹果(AFD32892.1)；AtGID1B.拟南芥(NP_191860.1)；MtGID1a. 蒺藜苜蓿(CAP64324.1)；AtGID1C. 拟南芥(NP_198084.1)；AtGID1A. 拟南芥(NP_187163.1)；TaGID1.小麦(CAP64334.1)；HvGse1.大麦(CAO98733.1)；OsGID1. 水稻(XP_015639961.1)；ZmGID1b. 玉米(CAP64328.1)；SbGID1. 高粱(CAP64329.1)；ZmGID1a. 玉米(CAP64327.1)图7 MsGID1b蛋白与其他物种GID蛋白的系统发育树Numbers at nodes indicate bootstrap value derived from 1000 replicates; The scale bar indicates genetic distance MtGID1b. Medicago truncatula(CAP64325.1)；CaGID1B. Cicer arietinum(XP_004493628.1)； GmGID1B. Glycine max(XP_003518940.1)；GoGID. Galega orientalis(ADO22685.1)；AhGID1. Arachis hypogaea(AIY56606.1)；MdGID1b. Malus domestica(AFD32891.1)；MdGID1c. Malus domestica(AFD32892.1)；AtGID1B. Arabidopsis thaliana(NP_191860.1)；MtGID1a. Medicago truncatula(CAP64324.1)；AtGID1C. Arabidopsis thaliana(NP_198084.1)；AtGID1A. Arabidopsis thaliana(NP_187163.1)；TaGID1. Triticum aestivum(CAP64334.1)；HvGse1. Hordeum vulgare(CAO98733.1)；OsGID1. Oryza sativa Japonica Group(XP_015639961.1)；ZmGID1b. Zea mays(CAP64328.1)；SbGID1. Sorghum bicolor(CAP64329.1)；ZmGID1a. Zea mays(CAP64327.1)Fig.7 Phylogenetic tree of MsGID1b and other GID proteins

2.3 MsGID1b基因在不同处理下的表达

对不同处理下紫花苜蓿MsGID1b的表达量进行检测分析，结果表明：MsGID1b对干旱胁迫、盐胁迫、赤霉素、脱落酸和黑暗处理均有明显响应。在黑暗处理下，MsGID1b表达量表现为升高，降低再升高的趋势(图8，B)。图8，C显示，在GA诱导下，MsGID1b响应显著，在2、4、8和12 h均有较高表达，在12 h时达到峰值，为对照的119倍，对GA处理的显著表达可能与该基因编码赤霉素受体有关。MsGID1b对ABA处理响应迅速，在2 h时表达量达到峰值，并迅速降低。在盐胁迫下，MsGID1b的表达量随着处理时间的增加而逐渐升高，在8 h时达到峰值，随后快速降低。干旱胁迫对其诱导作用最强，在处理2 h时，MsGID1b的表达量达到对照的2 000倍，4 h时明显降低，随后保持稳定(图8，C)，由此推测，MsGID1b可能参与了紫花苜蓿的抗逆调控。

图8 MsGID1b的组织表达特异性及不同处理下的表达模式Fig.8 Expression patterns of MsGID1b in different tissues and different treatments

3 讨 论

赤霉素受体广泛存在于植物中，它是赤霉素信号转导途径中的关键因子。前人在其他物种中成功克隆赤霉素受体基因并在相应物种中进行过表达后，发现赤霉素受体基因对植株的生物量有显著影响。本研究通过同源克隆的方法分离了紫花苜蓿赤霉素受体基因MsGID1b，序列分析结果表明，该基因编码的蛋白属于α/β折叠水解酶超家族，包含HSL超家族的HGG、GXSXG保守结构域以及与GA、DELLA蛋白的结合位点。不同物种赤霉素受体蛋白的系统发育树分析结果表明，紫花苜蓿MsGID1b与蒺藜苜蓿、鹰嘴豆、大豆、东方山羊豆、花生等豆科植物赤霉素受体蛋白相似性很高，其中，与蒺藜苜蓿的相似性为99%，以上结果表明MsGID1b可能是紫花苜蓿中的一个赤霉素受体基因。目前，NCBI上已登记注册2个蒺藜苜蓿赤霉素受体基因，玉米、苹果、葡萄、陆地棉等物种中也已发现多个赤霉素受体基因，紫花苜蓿与蒺藜苜蓿亲缘关系很近，且遗传关系复杂，故推测紫花苜蓿中的赤霉素受体基因可能是多基因家族。

MsGID1b在紫花苜蓿不同组织中存在显著的表达特异性。根中表达量最高，花中的表达量次之，荚果中表达量最低。这与IUCHI S等[28]得出的拟南芥AtGID1B在茎的伸长中为微效基因，但在根的生长和花的发育过程中为主效基因的结论一致。由此可以推测，MsGID1b参与了紫花苜蓿各组织的生长发育过程，并在植株根生长和花发育中发挥重要作用，其具体功能还需进一步的验证。研究结果表明，GA3处理后，MsGID1b的表达量迅速升高，且一直维持较高水平，这可能是由于在外界赤霉素的刺激下，大量赤霉素受体与赤霉素结合，从而导致赤霉素受体基因表达量升高。这与李俊所得东方山羊豆在GA3处理下的结论一致[21]。资料表明，脱落酸可以诱导许多逆境蛋白基因的表达，当植物受到渗透胁迫时，其体内的脱落酸水平会急剧上升，同时出现若干个特殊基因的表达产物。倘若植物体并未受到干旱、盐渍或寒冷引起的渗透胁迫，而只是吸收了相当数量的脱落酸，其体内也会出现这些基因的表达产物[29]。本研究中，在ABA处理下，MsGID1b在2 h时迅速升高后急速降低，并一直维持在较低水平，PEG模拟的干旱胁迫处理下，MsGID1b的表达趋势与ABA处理下的一致，而NaCl模拟的盐胁迫处理下，MsGID1b基因表达量在8 h时出现较大幅度的上升，并且NaCl和PEG处理下MsGID1b的表达量远高于ABA处理下的基因表达量，这与上述资料结论一致，由此可推测，MsGID1b基因可能参与植物的抗逆调控。

IUCHI等[28]通过单基因、双基因和三基因的突变证实了AtGID1A、AtGID1B和AtGID1C等3个基因的功能特异性及功能冗余。每一个AtGID1蛋白都能与其相对应的AtDELLA蛋白互作[11]，而GA信号转导是通过GID1与DELLA蛋白之间的互作，最终引起DELLA蛋白的降解来实现的[30-31]。为验证赤霉素受体基因是否能够影响紫花苜蓿的生物量，还应进一步探索紫花苜蓿中每个GID基因的功能特异性和功能冗余，以及与其互作的DELLA蛋白。

综上所述，本研究从紫花苜蓿中分离了1个赤霉素受体基因，初步探讨了该基因在紫花苜蓿各组织及各处理下的表达模式，为紫花苜蓿赤霉素受体基因的后续功能研究奠定了基础，并为紫花苜蓿分子育种提供了优异候选基因。

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(编辑:宋亚珍)

Cloning and Expression Analysis of Gibberellin Receptor Gene inMedicagosativaL.

CHEN Min, MA Lin, JIA Congjun, LIU Xiqiang, GONG Pan, WANG Zan*

(Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Gibberellin receptor (GID) plays an important role in gibberellin signal transduction pathway, which directly affects plant growth and development. In this study, a gibberellin receptor gene,MsGID1b, was first isolated fromMedicagosativaby homologous cloning. Sequence analysis showed that MsGID1b contains 350 amino acid residues with 39.839 kD molecular weight, and has high nucleotide (98%) and amino acid (99%) similarity with its orthologous gene inMedicagotruncatula. Physical and chemical properties analysis defined that MsGID1b was a kind of hydrophilic protein without signal peptide and transmembrane structures. MsGID1b contains the binding site of GA, DELLA and some conserved domain of hormone-sensitive lipase family (HSL) like HGG and GXSXG. Spatio and temporal expression profile investigated by real-time PCR indicated thatMsGID1bexpressed comprehensively with its highest expression level in root.MsGID1bwas sensitive to GA3, ABA, NaCl, PEG and dark treatments. It maintained a high transcript level under GA3treatment, suggesting thatMsGID1bmight participate in the response of abiotic stress ofM.sativa.

MedicagosativaL.; GID1b; homologous cloning; expression pattern

1000-4025(2016)11-2159-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2159

2016-07-30;修改稿收到日期:2016-10-31

现代农业产业技术体系建设专项(CARS-35-1)；国家国际科技合作专项 (2015 DFR30570)；中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS10)

陈 敏(1993-)，女，在读硕士研究生，主要从事牧草基因资源发掘与利用方面的研究。E-mail：carymin1993@163.com

*通信作者:王 赞，副研究员，硕士生导师，主要从事草类植物种质资源创新、重要性状基因发掘与利用研究。E-mail：wangzan@caas.cn

Q785;Q786

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