不同抗性马尾松无性系松材线虫病症状发展与松材线虫迁移、繁殖的关系

潘婷，陈雪莲，郝焰平，姜春武，徐六一

（安徽省林业科学研究院，合肥 230031）

不同抗性马尾松无性系松材线虫病症状发展与松材线虫迁移、繁殖的关系

潘婷，陈雪莲，郝焰平，姜春武，徐六一

（安徽省林业科学研究院，合肥 230031）

为了探索马尾松松材线虫病抗性机制，对广德20-5和广德34-1这两个具有不同松材线虫病抗性的7年生马尾松无性系接种了6 000头松材线虫，并分析接种1 d、5 d、9 d后两个无性系中症状的发展、松材线虫的数量和分布情况。结果发现，松材线虫的活动引起了这两个无性系的髓心的褐化和广德20-5针叶的枯萎，但褐化症状在广德34-1中较轻且扩散较慢，同时松材线虫在广德34-1中的繁殖和迁移速度也较广德20-5慢。表明广德34-1能抑制松材线虫在其体内迁移和繁殖，所以它对髓心褐化和针叶枯萎等松材线虫引起的症状表现出更高的抗性。

马尾松；松材线虫病抗性；迁移；繁殖；髓心褐化

马尾松（Pinus massoniana）是中国特有的乡土树种，分布面积居全国针叶林首位，蓄积量居第四位[6]。有研究表明，马尾松对松材线虫的抗性较强[7-8]，是松材线虫病抗性育种的好材料。2001～2008年，中日技术合作安徽省松材线虫抗性育种中心实施了“马尾松松材线虫抗性育种项目”，引用日本黑松和赤松松材线虫病抗性育种的成功经验，在全国率先开展了马尾松松材线虫病抗性育种工作。该项目自2001～2002年从松材线虫病疫区和非疫区马尾松林分中选取优良母树324株，采种育苗得到314个家系、44 430株苗木；2003～2005年分批对苗木进行两次人工接种松材线虫；2006年根据接种试验结果选拔出抗性马尾松候选家系251个，单株1 201株[9]；2008年对获得的马尾松抗性候选家系（单株）进行了嫁接，得到了马尾松抗性候选无性系318个；2009～2014年，在国家林业公益性行业科研专项经费项目“抗松材线虫病马尾松种源及抗性育种技术研究”资助下，安徽省林科院又对获得的马尾松抗性候选无性系进行了两次人工接种松材线虫测定，计算其生存率和健全率，并根据结果对无性系的抗性进行了等级划分，得到抗性指数为4、3、2和1的无性系分别有177、8、107和23个[10]。本试验以该项目选育出的抗性无性系为材料，进行松材线虫人工接种试验，分析不同抗性无性系接种后不同时间点体内线虫分布、数量的差异及症状表现的差异，初步探索马尾松对松材线虫病的抗性与松材线虫迁移和繁殖的关系。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

广德20-5和广德34-1是安徽省林科院选育出的抗松材线虫病马尾松无性系，广德34-1抗性高于广德20-5。两个无性系于2008年嫁接，种植在合肥林业科技示范园。合肥林业科技示范园位于117°12′E，31°55′N，地处安徽省合肥市庐阳区大杨镇董铺水库北缘，属暖温带季风大陆性气候，全年无霜期227 d，年平均气温15～15.7℃，年平均日照2 112 h左右，年平均降雨量986～1 300 mm，降雨主要集中在5～9月份。

1.1.2 松材线虫材料

通过贝曼漏斗法从安徽省全椒县瓦山林场在自然状况下受松材线虫病害致死的马尾松枯死木中分离出“瓦山1号”松材线虫株系。分离的松材线虫于 25℃培养在长满灰葡萄孢霉菌（Botrytis cinerea）的PDA培养基上。

1.2 方法

将广德20-5和广德34-1无性系各6株平分为两组，3株作为对照组，3株作为试验组。2015年9月，在每株植株上选取一枝直径相近的当年生新枝，截去顶梢并压碎切口，使用移液器向对照组切口注入100 μL蒸馏水，试验组则注入100 μL溶有6 000头松材线虫的蒸馏水。在接种后的第1、5和9 d对接种枝条进行采样，每次分别采两个无性系对照组和试验组的1株植株。观察接种枝条针叶的症状表现后，去掉针叶，以接种点为起点将枝条截为5段长5 cm的茎段，收集接种点以下0～5 cm、10～15 cm和20～25 cm三节茎段，记为A、C和E。收集的茎段迅速放入冰盒中带回实验室4℃保存。

在采集样品时对接种松枝进行观察，检查其生长状况和针叶颜色是否发生变化；并对采集回来的茎段进行解剖，肉眼观察接种引起的马尾松组织中的病理变化。

采用贝曼漏斗法对采集的茎段样品进行松材线虫分离。将解剖过的茎段包裹在两层纱布中并放入连接有橡胶管的漏斗中，加入蒸馏水浸泡24 h，打开止水夹采集橡胶管底端滤液5 mL，并用解剖镜对滤液中的松材线虫进行计数。

2 结果和分析

2.1 人工接种后症状表现的差异

就外部针叶症状看（表1），广德34-1的试验组和两个无性系的对照组植株在接种后的9 d内针叶均为绿色，没有出现失色的情况；而广德20-5的试验组在接种松材线虫后第9 d A段出现针叶失水变黄的症状。

解剖观察茎段组织内部情况（图1），发现广德20-5和广德34-1的试验组和对照组都出现了髓心褐化的情况，即髓心由浅黄绿色转为褐色。接种后第5 d两个无性系的试验组和广德34-1的对照组都出现了髓心褐化现象。其中广德20-5的褐化程度最重，褐化范围也最广，达到C段；而广德34-1的试验组和对照组褐化较轻，程度接近，且都只出现在A段。接种后第9 d，广德34-1的试验组C段出现褐化现象，程度较轻，A段褐化加重超过对照。而此时，其余组的褐化程度都较第5 d加重。其中最严重的是广德20-5的试验组，其A段髓心完全褐化，甚至皮层也出现褐化，其C段褐化也继续加重。广德20-5的试验组A段和C段的褐化程度都远远超过此时广德34-1试验组。整个过程中，两个无性系对照组褐化范围都只集中在A段，而试验组则都最终扩展到了C段，褐化程度上试验组也都超过了各自对照组，同时广德20-5试验组的褐化范围扩展速度和褐化程度也一直高于广德34-1。

图1 广德20-5和广德34-1中髓心褐化症状的发展

2.2 松材线虫繁殖和迁移速度的差异

对采集的茎段样品进行线虫分离计数，结果见表1。在广德20-5中松材线虫数量不断增加，繁殖速度很快，线虫总数由接种后第1 d的4条到第5 d和第9 d的14和137条，数量分别增加了2.5和34.25倍；而广德34-1中松材线虫数量在采样时间内一直维持在低水平，繁殖较慢，从接种后的第1 d 2条到第9 d的4条，线虫只增加了一倍，中间第5 d甚至没有松材线虫检出。松材线虫在马尾松体内繁殖的同时向主枝方向扩散，但在广德20-5和广德34-1中线虫扩散的速度不同。松材线虫在接种后第1 d都只在两个无性系的A段检出，广德20-5在C段检出是接种后第5 d，而广德34-1是第9 d，两者E段检出时间和各自C段相同，由此可见松材线虫在广德20-5中迁移更快。

表1 松材线虫在广德20-5和广德34-1中的数量和分布

3 讨论

（1）试验组和对照组在削顶接种线虫后都出现了髓心褐化的现象，但试验组在褐化程度和范围两方面都超过对照组，说明松材线虫在马尾松无性系中的活动会引起植物髓心褐化。刘军民等[11]和陈玉惠等[12]也报道了松材线虫接种引起马尾松离体松枝和1年实生苗髓心褐化的现象。松材线虫在植物体内的活动引会起植株输水堵塞，水势下降[13-14]，可能由此引起马尾松髓心的失水褐化。本试验中对照组削顶接种蒸馏水后伤口未做处理，直接曝露于空气中，出现接种点以下小范围的髓心褐化现象，这说明了髓心褐化现象不仅会出现在接种了松材线虫的马尾松材料中，也会出现在接种蒸馏水且暴露伤口的马尾松新枝中。而在陈玉惠等的试验中接种的切口敷有湿润的脱脂棉，保持了切口的湿润，空白对照则没有出现褐化的现象。对比试验说明对照组的髓心褐化现象可能是由于接种枝曝露的伤口大量散失体内水分引起的。

（2）分析广德34-1和广德20-5试验组的褐化症状发展和松材线虫的数量和分布变化，可以看到两个无性系髓心的褐化程度加重、褐化范围扩大的同时，体内松材线虫数量也增加、分布范围也扩大。在松材线虫扩散和褐化范围扩展方面，两个无性系中松材线虫扩散到E段时，其髓心的褐化也分别扩散到C段，褐化范围的扩展稍微滞后于线虫的扩散。在松材线虫繁殖和褐化程度加重方面，广德34-1体内松材线虫的数量一直维持在低水平，其褐化程度也比较接近其对照；而广德20-5体内随着松材线虫数量的不断增加，其髓心褐化程度不断加重，远远超过其对照，最终在松材线虫数量爆发增长的第9 d时，其A段髓心和皮层彻底褐化，该段针叶也同时出现黄化[15]。不难看出，马尾松髓心褐化范围和程度与线虫的迁移和繁殖有关，褐化的范围随着松材线虫的扩散而扩大，但速度滞后于线虫扩散速度，同时髓心褐化的程度随着松材线虫数量增加而加重，直至髓心彻底褐化且针叶表现出失水黄化病征。

（3）松材线虫在广德34-1体内的繁殖和迁移速度都比广德20-5慢，说明相较广德20-5，广德34-1体内一定存在着抑制松材线虫繁殖和迁移的机制。通过这种相对的抑制，广德34-1的褐化程度比广德20-5低，褐化范围扩展也比广德20-5慢，最终抑制了植物髓心褐化现象的迅速恶化，防止了针叶黄化症状的出现，表现出比广德20-5高的松材线虫病抗性。在黑松和赤松中也发现松材线虫病抗性无性系与非抗性或感病无性系相比可以抑制松材线虫的繁殖和迁移，从而抑制松材线虫病病程的发展[16-17]，但其具体机制仍然没有被明确揭示，有待进一步的研究。

（4）本试验中马尾松无性系广德34-1在接种松材线虫后表现出比广德20-5高的抗性，这与它们6年前接受的两次接种试验的综合抗性评定结果相反。分析后认为，造成抗性发生逆转的原因可能有以下三个。首先是无性系树龄的变化。在日本对黑松的松材线虫病抗性育种研究中就发现，选育出的黑松抗性随着树龄增长存在变化，且该抗性的变化在不同家系间具有差异性[18]，所以在广德34-1的抗性可能后来居上超过广德20-5。其次是接种线虫的不同。6年前接种所使用的“广朱3B”松材线虫株系在多次继代培养后繁殖力和致病力都急剧退化[19]，不再使用；本次试验采用的是“瓦山1号”株系。来自不同的地理位置的松材线虫株系对马尾松的致病性不同[20]，这也可能是造成两次试验结果不同的原因。最后是本次接种试验采用样本数量较少。因为6年前两次接种试验存活下来的无性系数目有限，因此，本试验每个马尾松无性系只对3株植株进行了松材线虫接种，由于个体的差异，其结果可能存在偏差，造成两次的试验结果不同。最终是哪种或几种原因造成两个马尾松松材线虫病抗性无性系广德34-1和广德20-5抗性高低发生逆转需要进一步的验证。

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（责任编辑：杨婷婷）

Relationship between Symptom Development of Pinewood Nematodiasis and Migration and Reproduction of Pinewood Nematode in Pinus massoniana Clones with Different Resistance

PAN Ting,CHEN Xuelian,HAO Yanping,JIANG Chunwu,XU Liuyi
(Anhui Academy of Forestry,Hefei 230031,China)

In this paper,in order to explore the pinewood nematodiasis-resistance mechanism,7-year-old Pinus massoniana clones Guangde 20-5 and Guangde 34-1 with different nematodiasis resistance were selected and inoculated with 6 000 pinewood nematodes and an analysis was made on the symptom development,number and distribution of nematodes in the clones 1 d、5 d and 9 d after inoculation.The results showed that the nematode activities caused pith browning in both of the clones and needle withering in Clone 20-5,while the pith browning symptom was milder and spread more slowly in Clone 34-1 than in 20-5 and both the speeds of reproduction and migration of nematodes were slower in Clone 34-1.It showed that compared with Clone 20-5,Clone 34-1 could suppress internal reproduction and migration of nematodes and showed higher resistance to the symptoms induced by nematodes like pith browning and needle withering.

Pinus massoniana;Pine nematodiasis resistance;Migration;Reproduction;Pith browning

S763.3

A

2095-0152（2016）06-0013-04

016-08-29

2016-09-25

潘婷（1989-），女，研究实习员，研究方向：马尾松松材线虫病抗性育种。E-mail:pantene14@163.com的松材线虫病给我国带来了巨大的生态压力和经济损失。据国家森防总站不完全统计，截止2015年，全国累计致死松树5亿多株，造成直接、间接经济损失约275亿元。

松材线虫病是由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）入侵引起的松树萎蔫病[1]，松材线虫通过松褐天牛（Monochamus alternatus）噬咬松树幼嫩组织时产生的伤口进入植物树脂道[2-3]，以树脂道薄壁细胞为食并进行大量繁殖，沿着树脂道迁移，引起植物失水，最终导致植株由冠层开始自上而下整株枯萎。

松材线虫病对于松属植物是毁灭性的，它能够在短时间内造成松树大量死亡，有松树“癌症”之称。目前松材线虫主要分布在美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙、日本、韩国和中国。自从1982年我国首次在南京中山陵黑松中发现松材线虫病以来[4]，疫情迅速蔓延。根据中国林业网报告，到2015年我国内地松材线虫病疫区已经达到187个，分布在江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、云南和陕西，共计16省（市、自治区）。此外香港和台湾也分别在1982年和1983年发现了松材线虫病，现也已广为分布[5]。大面积蔓延