猪化脓性链球菌的分离鉴定及耐药性分析

赵明礼 （齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

猪化脓性链球菌的分离鉴定及耐药性分析

赵明礼 （齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

本试验利用山东某猪场发生临床症状疑似链球菌疾病的猪，采集内脏器官(肝脏、脾脏)。通过菌落形态、镜检、生化实验及PCR鉴定，筛选出1株化脓性链球菌，并进行了6种抗生素的药敏试验，发现分离菌株对四环素、克拉霉素、壮观霉素和红霉素有很强的耐药性，对头孢喹肟和青霉素高度敏感，敏感药物是猪场防控猪化脓性链球菌的首选药物。

猪化脓性链球菌 分离鉴定 药敏试验

猪化脓性链球菌病是由猪链球菌感染引起的一种常见传染病，其危害日益严重。链球菌可引起猪的多种疾病，侵害各年龄段的猪只，通常以败血症、脑膜炎、关节炎、淋巴结炎为主要特征，人接触病死猪可感染发病[1]。1998-1999年夏季中国江苏省部分地区猪群中爆发链球菌病，导致相关人员感染致死；2005年中国四川再度爆发此疾病，同样导致人员死亡的现象，给养殖业带来了巨大的经济损失的同时，严重危害人类的公共卫生安全[2]。

2015年11月中旬，山东某猪场发生个别的死亡现象，死前呼吸困难，沙哑，病死猪剖检气管有泡沫样物质，肝脏肿大，呈土黄色，脾脏硬，稍肿大，心脏几乎没有太大的变化，肾脏正常，为了探讨该猪场病因，进行实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 该猪场病死猪的肝脏、脾脏等病变病料。

1.1.2 培养基 脑心浸液培养基，普通肉汤培养基等由市售商品；

1.1.3 生化试剂 乳糖、棉子糖、甘露醇、卫矛醇、水扬苷、山梨醇、精氨酸、七叶苷、木糖、蔗糖和葡萄糖，由杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器 电热恒温培养箱DRP-9162型(上海森信实验仪器有限公司)、显微镜(NIKON公司)、恒温摇床TH2-300(上海一恒科学仪器有限公)、洁净工作台SW-CJ-2FD型(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、梯度PCR仪S1000(北京金业德祥科技有限公司)、BG-Power600i型电泳仪(西安超杰生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 在超净工作台下无菌挑取脾脏、肝脏病变部位，直接划线接种于血平板上，置于37℃恒温培养箱内培养18～24h，观察结果。在血平板上挑取菌落，接种于脑心浸液培养基中，放入恒温摇床内震荡8～10h，吸取10ul的菌液分别进行涂片，再革兰氏染色，镜检，观察细菌的形态。

1.2.2 生化试验 用已灭菌的接种环蘸取少量的细菌纯培养液分别接于生化微量管：乳糖、棉子糖、甘露醇、卫矛醇等。置于37℃培养箱内培24h观察结果。

1.2.3 PCR鉴定 （1）引物的设计与合成：根据GenBank中化脓性链球菌23sRNA基因序列设计扩增引物，F(上游)：5’-TGGAGGTAGAGCACTGTTTG-3’；R(下游)：5’-TTCTCACTTCTATGCGTTCC-3’，目的片段397bp，引物委托哈尔滨博仕生物有限公司合成。（2）细菌DNA的提取：按照细菌DNA提取试剂盒的使用说明来提取即可，-20℃保存。（3）PCR扩增：以提取的细菌DNA为模板，PCR反应体系50μl：DNA2μl，上引1μl，下引1μl，DNTP2.5μl，10×Buffer5μl，Tap酶1μl，ddH2O37.5μl；PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30″，52℃退火30″，72℃延伸30″，30个循环。（4）DNA琼脂糖凝胶电泳：取10μl的PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，120V，15min。以DNA Marker DL2000为标准分子量，在紫外灯下观察电泳结果并照相。

1.2.4 药敏试验 应用WHO推荐的改良药敏纸片扩散法（K-B法），按照NCCLS上的标准来做：先将纯培养的菌液计数，然后稀释到1～1.5×108cfu/ml。取100ul滴于普通肉汤琼脂平板中，用已灭好的涂布棒涂匀，再用灭菌尖头镊子将药敏片平铺在肉汤琼脂平板上，并且轻轻的压紧，每个平板上贴5个药敏片，药敏片一旦接触平板，就不能在移动。最后将贴纸片的平板底部在下，在37℃恒温培养18h～24h，分析结果。

2 试验结果

2.1 细菌的培养特性

经过37℃恒温培养箱内培养24h后，在血平板上生长良好，呈溶血现象，中等大小，不透明，灰白色，圆形，中央隆起，边缘整齐，光滑湿润(图1)。

图1 分离菌在血平板上的菌落形态

2.2 镜检结果

在固体培养基上镜检为G+，短链(图2)，在液体培养基上镜检为G+，长链(图3)。

图2 固体培养基上菌落的镜检结果

图3 分离菌液的镜检结果

2.3 生化试验结果

在恒温培养箱内取出已接菌的生化微量鉴定管，根据颜色的变化，按照生化试验结果判定标准来判断(有的需要指示剂来进一步的判定)。

表1 分离菌株生化试验结果

2.4 PCR鉴定结果

取PCR扩增产物5～8μl，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，120V，15min。在397bp处均扩增出目的片段，与阳性对照片段吻合(图4)。

2.5 药敏试验结果

抑菌环的大小与1994年12月版的《美国NCCLS药敏试验纸片扩散法法规》做对比来分析判定药敏试验结果：

图4 PCR扩增结果M：DNA Marker DL2000；1：分离菌株；2：阳性对照

表2 分离菌株药敏试验结果

3 讨论

（1）根据临床剖检变化及生化试验和PCR等实验室诊断结果，可以初步鉴定引起猪场死亡的主要病原是化脓性链球菌，由于没有做血清学分析，具体是哪个血清型还有待于进一步研究。（2）通过药敏试验可知，对头孢喹肟和青霉素的敏感性较高，与毛剑虹等[3]报道相符，对大多数抗生素均有耐药性，但对红霉素等部分抗生素有很强的耐药性，在国内董太明等[4]报道1993～1994年吉林、四川、广州等地分离出376株化脓性链球菌中，对红霉素耐药率高达43.3%，香港地区报道2001～2002年耐药率达32%[5]。药敏试验结果基本符合当前在大、中、小三种类型猪场对仔猪进行保健的药物使用情况，目前保健药物主要是头孢类，目的主要是防控保育期的链球菌的发生。

4 结论

该猪场发病的主要病原为猪化脓性链球菌，并对病猪注射头孢喹肟或青霉毒敏感性较高的药物，其他猪至今没有伤亡，得到了一定的控制。

[1] 王海丽, 赵德明, 葛长城等. 猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性试验[J]. 中国兽医杂志, 2012,48(7): 36-39.

[2] 李彩英, 岳修伟, 侯怡轩等. 上海地区31株2型猪链球菌的分离鉴定及其耐药性分析[J]. 中国动物传染病学报, 2011,19(6): 54-59.

[3] 毛剑虹, 吕火祥. 临床分离化脓性链球菌的耐药性分析[J]. 浙江医学, 2008, 30(5): 483-484.

[4] 董太明, 苏健, 黄震东等. 我国部分地区儿童A组链球菌耐药性的研究[J]. 中华儿科杂志, 1999, 37(1): 35- 37.

[5] Ho PL, Johnson D R, Yue AWY, etal.Epidemiologic analysis of invasive and noninvasive group A streptococcal isolates in Hong Kong JC lin Microbiol, 2003, 41: 937-942.

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