基因表达载体相关问题解读

吴浩

基因工程操作的核心是构建基因表达载体，围绕表达载体的考题有逐年增多的趋势。下面从不同的角度对表达载体进行解读。

一、基因表达载体的一般结构及各部分的功能

如上图，基因表达载体一般由目的基因（插入基因）、启动子、终止子、标记基因（抗生素抗性基因）等结构组成。

启动子是复制原点附近的一段有特殊结构的DNA，位于基因的首端。启动子和特定的物质（如激素）作用后，通过一系列复杂的正反馈机制，激活复制原点（复制原点通常与某些酶结合）。

终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录或复制在所需要的地方停止下来。

复制原点处的A和T特别多，氢键相对较少，不稳定，DNA容易解旋，因此易与引物结合，成为转录的起点或复制的起点。

抗生素抗性基因作为标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。标记基因又称报告基因，抗生素抗性基因是其中的一种。

二、基因表达载体中启动子、终止子的来源及特点

（1）如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。（2）如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体细胞，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录或复制的，因此，在构建基因表达载体时，在与质粒结合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。（3）特异性启动子。组织特异性启动子又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。如用乳房生物反应器生产药用蛋白，使用的便是该类基因。

三、标记基因是否为质粒结构

作为运载体必须具备以下几个特点：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。质粒是基因工程最常用的运载体，它存在于许多细菌等生物体中，是能够自主复制的很小的环状DNA分子。根据此分析可知，标记基因是质粒上固有的。但在实践中，由于构建载体的目的不同，需要的标记基因也会不同，有的标记基因是需要另外加上的，如将绿色荧光蛋白基因与目的基因做成融合基因，根据荧光蛋白的特性来确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位。

四、载体上标记基因的标记原理

载体上的标记基因一般是一些抗生素抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如上图所示。