比索洛尔联合培哚普利对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心肌内质网应激的影响

吴锦波， 叶小汉， 冼绍祥， 董明国

(1 广州中医药大学博士后流动站，广东 广州 510405； 2东莞市中医院心内科，广东 东莞 523000；3广州中医药大学第一附属医院心内科，广东 广州 510405)



比索洛尔联合培哚普利对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心肌内质网应激的影响

吴锦波1, 2△， 叶小汉2， 冼绍祥3， 董明国2

(1广州中医药大学博士后流动站，广东 广州 510405；2东莞市中医院心内科，广东 东莞 523000；3广州中医药大学第一附属医院心内科，广东 广州 510405)

目的： 探讨比索洛尔联合培哚普利对心力衰竭大鼠内质网应激的影响。方法:采用阿霉素腹腔注射法建立大鼠心力衰竭模型，随机分为正常对照组、假手术组、模型组、比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利治疗组，按分组设置分别以蒸馏水、比索洛尔、培哚普利和比索洛尔+培哚普利连续灌胃35 d。观察大鼠心功能指标，ELISA法检测血浆脑钠肽水平，TUNEL法检测心肌细胞凋亡并计算凋亡指数，Western blot法检测心肌GRP78、CHOP、SERCA2a、JNK和caspase-12表达水平。结果:与正常对照组和假手术组比较，模型组大鼠心输出量、左室短轴缩短率和射血分数显著降低，心肌细胞凋亡指数显著升高，心肌SERCA2a表达显著降低，GRP78、CHOP、JNK和caspase-12表达显著升高(P<0．01)。与模型组比较，比索洛尔治疗组、培哚普利治疗组和比索洛尔+培哚普利治疗组大鼠心输出量、左室短轴缩短率和射血分数显著升高，心肌细胞凋亡指数显著降低，SERCA2a表达显著升高，GRP78、CHOP、JNK和caspase-12表达显著降低(P<0．05)；除JNK外，比索洛尔+培哚普利治疗组的其余各个指标与比索洛尔组和培哚普利组比较均有显著差异(P<0．05)。结论:比索洛尔联合培哚普利可以明显改善阿霉素诱导的心力衰竭大鼠的心功能，两药合用效果更显著，机制可能与下调内质网应激蛋白表达，降低内质网应激水平，减少心肌细胞凋亡有关。

比索洛尔； 培哚普利； 心力衰竭； 内质网应激； 细胞凋亡

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多种心血管疾病的终末期表现，随着人口老龄化，CHF的患病人数不断增加；虽然医学发展改善了CHF患者的预后，但其5年病死率仍高达50%[1]。动物实验和人体研究表明内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)启动细胞凋亡参与CHF的病理生理过程[2]。氧化应激、缺血、钙稳态失衡等各种刺激因素均可导致ERS，适度的ERS是细胞的一种自我保护性机制，可以修复内质网稳态；而持续或严重的ERS则可诱导C/EBP同源蛋白 (C/EBP homologous protein，CHOP) 、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)等促凋亡因子的表达和活化，介导心肌细胞凋亡[3-5]。肌浆网钙ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a，SERCA2a)的表达水平和活性降低可以导致钙稳态失衡而引发ERS[6]。内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78) 是内质网稳态的感受器，是ERS的标志性蛋白[3]。

β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor，β-AR)阻滞剂可以上调衰竭心脏β1-AR密度并恢复其正常功能，改善心功能，提高左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)[7]；β受体阻滞剂还可以使衰竭心脏SERCA2a的蛋白水平和活性正常化，恢复钙稳态，减轻ERS，改善心功能[6]。血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEIs)可以降低肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)活性，减少血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)的生成，抑制心肌重构，改善心功能。其中，培哚普利在改善心功能的同时，可以降低GRP78和caspase-12的表达，提示培哚普利可以阻断ERS，保护心肌细胞[8]。β受体阻滞剂和ACEIs常联合应用，已经成为治疗CHF的基石[7]。然而，比索洛尔联合培哚普利对阿霉素引起的心功能障碍有何影响？尚缺乏研究。 本实验通过阿霉素腹腔注射法建立大鼠CHF模型，观察比索洛尔联合培哚普利治疗对阿霉素诱导的心功能障碍大鼠的心功能和ERS的影响，探讨比索洛尔联合培哚普利治疗阿霉素性CHF的分子机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物和药物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，平均体质量(230±20)g，由广州中医药大学动物实验中心提供[动物许可证号：SCXK(粤)2013-0020；动物合格证号：No.440059000]。SPF级净化空间，生长条件为12 h/12 h光照周期，温度(22±3) ℃，相对湿度(40～70)%，自由摄食、饮水。动物饲养及动物实验方案遵循国家《实验动物管理条例》和广州中医药大学伦理委员会动物实验规范。

比索洛尔(Merck Serono)189 mg加无菌蒸馏水2 100 mL，制成浓度为0.09 g/L的溶液，灌胃剂量为0.9 mg·kg-1·d-1。

培哚普利[施维雅(天津)制药有限公司]151.2 mg加无菌蒸馏水2 100 mL，制成浓度为0.072 g/L的溶液，灌胃剂量为0.72 mg·kg-1·d-1。

阿霉素(Medchemexpress LLC)；氯胺酮(福建古田药业)；地西泮(天津金耀药业)。

2 试剂和仪器

大鼠脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP) ELISA 试剂盒购自RayBiotech.Inc.。TUNEL试剂盒购自Roche；二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒购自博士德生物技术有限公司。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度测定试剂盒由碧云天生物技术研究所提供；GRP78抗体、CHOP抗体、JNK抗体、caspase-12、SERCA2a抗体和β-actin抗体均购自Santa Cruz；GAPDH由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；辣根过氧化物酶抗体购自Jackson。增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂盒购自Millipore。HP5500心脏超声仪(HP)；GDS7600凝胶扫描系统(UVP)。

3 动物造模及分组

雄性SD大鼠适应性喂养1周后，采用阿霉素腹腔注射法(用灭菌注射用水溶解成0.25 g/L溶液,每次注射剂量为2.5 mg/kg，2周内分6次注射，总剂量15 mg/kg)建立CHF大鼠模型。首次腹腔注射5周后应用心脏超声仪检测并计算左室短轴缩短率(fractional shortening,FS)，以心腔扩大，FS<30%作为CHF成模标准[9]。80只大鼠分别随机选取10只作为正常对照组，10只作为假手术组，假手术组腹腔注射10 mL/kg的生理盐水。剩余60只大鼠用于造模，将成功造模大鼠按随机数字表法随机分为4组：模型组、比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组，分别以比索洛尔(0.9 mg·kg-1·d-1)、培哚普利(0.72 mg·kg-1·d-1)和比索洛尔(0.9 mg·kg-1·d-1)+培哚普利(0.72 mg·kg-1·d-1)灌胃，每天1 次，连续35 d；其余各组以10 mL/kg的蒸馏水灌胃。

4 大鼠心功能指标检测

干预前后采用腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和地西泮(5 mg/kg)混合麻醉大鼠，胸前剃毛，大鼠取仰卧位，固定在木板上，应用心脏超声仪，分别测量左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)和左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)，计算FS、心输出量(cardiac output, CO)和左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)。

5 ELISA法检测血浆BNP水平

处死大鼠时腹主动脉取血，肝素抗凝，静置1 h，3 000 r/min离心10 min，取上清-20 ℃冰箱保存，按试剂盒说明书进行操作。

6 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

大鼠超声心动图检测结束后，立即注射2 mmol/L的KCl，使大鼠心脏停搏在舒张末期，迅速开胸离断心脏，PBS冲洗干净后，石蜡包埋、切片，5% BSA封闭30 min，加TUNEL反应混合液37 ℃ 1 h，加Converter-POD反应液37℃ 30 min，DAB显色液室温反应约10 min，透明封片，镜检显示凋亡的心肌细胞核呈棕黄色。计算凋亡指数(apoptotic index，AI)，AI=凋亡阳性细胞数目/总细胞数目，每张切片观察6个视野求均值。

7 Western blot 检测心肌细胞的蛋白表达水平

取100 mg心肌组织，加入裂解液，冰上裂解1h，提取细胞内蛋白，用BCA法进行蛋白定量。取各组蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用牛血清蛋白封闭，经Ⅰ抗结合后洗膜，Ⅱ抗结合，洗膜后采用ECL 法显色，软件分析。并分别以GRP78、CHOP、JNK和caspase-12的平均灰度值与相应内参照蛋白GAPDH的平均灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量，SERCA2a平均灰度值与相应内参照蛋白β-actin的平均灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

8 统计学处理

实验数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0 统计软件包进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析， LSD法进行组间两两比较，率的比较采用χ2检验，以P<0．05 为差异有统计学意义。

结 果

1 一般情况

采用阿霉素腹腔注射法造模共60只，造模过程中有15只大鼠死于严重心力衰竭和肝硬化腹水，死亡率为25%；FS不达标5只，成模率为67%。40只成功造模大鼠按随机数字表法分成4组：模型组、比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组，每组10只，在随后的实验干预中，每组各有1只大鼠因灌胃不当而死亡。CHF大鼠出现不同程度的食欲减退、精神较差、张口呼吸和乏力等症状。模型组、比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组术后体重分别为(325.0+50.8)g、(338.6±57.4)g、(340.9±52.6)g和(332.7±68.5)g，均明显低于正常对照组的(443.2±69.3)g和假手术组的(444.7±44.5)g (P<0．01)；术后5周内模型组、比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组大鼠体重有不同程度回升，分别为(343.5±86.1)g、(475.2±32.7)g、(478.8±25.8)g和(481.3+26.5)g，后3组明显高于模型组(P<0．01)。

2 大鼠心功能指标

干预后，模型组FS、CO和LVEF明显低于正常对照组和假手术组(P<0．01)；比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组FS、CO和LVEF明显高于模型组(P<0．01)，比索洛尔+培哚普利组明显高于比索洛尔组和培哚普利组(P<0．05)，见表1。

3 血浆BNP水平

模型组血浆BNP水平显著高于正常对照组和假手术组(P<0．01)，比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组显著低于模型组(P<0．01)，比索洛尔+培哚普利组明显低于比索洛尔组和培哚普利组(P<0．05)，见表1。

表1 大鼠心功能指标与血浆BNP水平

4 心肌细胞凋亡

光镜下观察，凋亡细胞核呈棕黄色，见图1。模型组心肌细胞凋亡指数显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01)；比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组显著低于模型组(P<0.01)，比索洛尔+培哚普利组显著低于比索洛尔组和培哚普利组(P<0.05)，见图1。

Figure 1.Apoptosis of cardiomyocytes of rats in different groups (TUNEL staining,×400).

图1 各组大鼠心肌细胞凋亡情况

5 大鼠心肌细胞的蛋白表达水平

模型组GRP78、CHOP、JNK和caspase-12的蛋白表达水平显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01)，比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组显著低于模型组(P<0.05)。比索洛尔+培哚普利组GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表达水平显著低于比索洛尔组和培哚普利组(P<0.05)。模型组SERCA2a的蛋白表达水平显著低于正常对照组和假手术组(P<0.01)，比索洛尔组、培哚普利组和比索洛尔+培哚普利组显著高于模型组(P<0.01)，比索洛尔+培哚普利组显著高于比索洛尔组和培哚普利组(P<0.05)，见图2～4。

讨 论

CHF以其庞大的患病人数、沉重的社会经济负担和居高不下的死亡率，成为全球性的公共卫生问题。受益于循证医学的发展和大规模临床试验的开展，CHF的治疗方案得到不断优化。CHF的现有治疗方法，包括β受体阻滞剂和ACEIs/血管紧张素受体阻滞剂、醛固酮拮抗剂，可以明显改善心功能、提高生活质量、减少住院时间、改善预后，降低死亡率。然而，CHF的发病率却有增无减，这与人口老龄化加剧，多种类型的心血管疾病最终演变成CHF有关[1]。神经内分泌过度激活和细胞凋亡是CHF的2个关键过程，它们共同参与的病理性心肌重构是CHF的主要病理生理机制；抑制神经内分泌过度激活和细胞凋亡是有效预防和治疗CHF的基础[7]。β受体阻滞剂和ACEIs联合应用既可以阻断CHF患者神经内分泌系统的过度激活，又可以减轻ERS介导的细胞凋亡，已成为CHF的常规治疗手段，但其具体分子机制仍未完全明确。

Figure 2.Relative expression of GRP78 and CHOP in the myocardium of rats. Mean±SD.n=9～10.*P<0.05,**P<0.01vssham；#P<0.05,##P<0.01vsDOX；△P<0.05vsDOX+Bis+Per.

图2 大鼠心肌细胞GRP78和CHOP的相对表达水平

Figure 3.Relative expression of caspase-12 and JNK in the myocardium of rats. Mean±SD.n=9～10.**P<0.01vssham；#P<0.05,##P<0.01vsDOX；△P<0.05vsDOX+Bis+Per.

图3 大鼠心肌细胞caspase-12和JNK的相对表达水平

Figure 4.Relative expression of SERCA2a in the myocardium of rats. Mean±SD.n=9～10.**P<0.01vssham；##P<0.01vsDOX；△P<0.05vsDOX+Bis+Per.

图4 大鼠心肌细胞SERCA2a的相对表达水平

衰竭心脏中SERCA2a的含量和/或活性降低使肌浆网摄取Ca2+减少[10]，导致细胞内钙超载，钙稳态失衡可引发ERS。内质网增生是CHF的一个突出组织学表现，提示内质网超负荷；衰竭心脏中的氧化应激、缺氧、蛋白质合成增加都可导致内质网稳态失衡，诱发或加重ERS[11]。ERS通过CHOP、JNK和caspase-12途径诱发细胞凋亡[12]。在CHF早期，心肌细胞凋亡轻度增加，随着时间推移，累计的细胞凋亡导致心肌细胞显著减少，促进心肌重构[13]，使心功能进一步恶化。研究显示，在终末期心肌病心衰患者的心脏中每100万个心肌细胞就有673～6 549个细胞核中出现了凋亡现象,平均是正常心脏的232倍[14]。减轻ERS可以抗凋亡，能减轻或逆转心肌重构，改善心功能[15]。

本实验通过阿霉素腹腔注射法建立大鼠CHF模型，发现模型组大鼠心肌SERCA2a蛋白含量降低，提示内质网功能障碍；GRP78升高提示发生了ERS，ERS的发生与SERCA2a的降低相关；虽然SERCA2a降低不是破坏内质网稳态和诱发ERS的唯一因素，但是可以推断，ERS的发生至少部分归因于SERCA2a的降低。本实验中，模型组大鼠心肌细胞凋亡明显增加，可能是大鼠心功能恶化的重要原因。另外，大鼠心肌CHOP、JNK和caspase-12升高提示这3条细胞凋亡信号通路均被激活，均参与介导心肌细胞凋亡；其中，caspase-12仅特异性地与ERS相关，与非ERS介导的细胞凋亡无关[16]，更显示出ERS在细胞凋亡和CHF发生发展过程中的重要性。本实验中，比索洛尔和培哚普利均可以提高心肌SERCA2a蛋白含量，降低GRP78、CHOP、JNK和caspase-12水平，提示比索洛尔和培哚普利可以恢复内质网功能，减轻ERS，减轻心肌细胞凋亡，改善心功能；其中，比索洛尔联合培哚普利的抗ERS、抗凋亡作用效果最强。本实验提示：SERCA2a、CHOP、JNK和caspase-12均参与了ERS和心肌细胞凋亡过程，比索洛尔和培哚普利的干预可以调控这几种蛋白的表达，减轻ERS和心肌细胞凋亡。这也许是比索洛尔和培哚普利改善CHF患者心功能的一种分子机制。

此外，本实验使用动物样本量少，而且是小动物，只针对阿霉素诱导的特定心衰模型，比索洛尔和培哚普利的效应及其治疗心衰的分子机制有待大规模的动物实验和临床试验来进一步验证和解答。

[1] Burchfield JS, Xie M, Hill JA. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2 [J]. Circulation, 2013，128(4):388-400.

[2] Okada K, Minamino T, Tsukamoto Y, et al. Prolonged endoplasmic reticulum stress in hypertrophic and failing heart after aortic constriction: possible contribution of endoplasmic reticulum stress to cardiac myocyte apoptosis[J]. Circulation, 2004，110(6): 705-712.

[3] Groenendyk J, Sreenivasaiah PK, Kim DH, et al. Biology of endoplasmic reticulum stress in the heart[J]. Circ Res，2010，107(10):1185-1197.

[4] Liu MQ, Chen Z, Chen LX. Endoplasmic reticulum stress: a novel mechanism and therapeutic target for car-diovascular diseases[J]. Acta Pharmacol Sin，2016，37(4):425-443.

[5] Minamino T, Komuro I, Kitakaze M. Endoplasmic reticulum stress as a therapeutic target in cardiovascular disease[J]. Circ Res，2010，107(9):1071-1082.

[6] George I, Sabbah HN, Xu K, et al. β-adrenergic receptor blockade reduces endoplasmic reticulum stress and normalizes calcium handling in a coronary embolization model of heart failure in canines[J]. Cardiovasc Res, 2011，91(3):447-455.

[7] 中华医学会心血管病学分会，中华心血管病杂志编辑委员会．中国心力衰竭诊断和治疗指南2014 [J]．中华心血管病杂志，2014，42(2)：98-122．

[8] 何云云，刘春蕾，李 鑫，等. 培哚普利对心肌梗死大鼠内质网应激分子GRP78和caspase-12表达的影响[J]. 解放军医学杂志, 2014，39(1):1-4.

[9] 白 剑,顾 蓉,王丙剑，等．过表达整合素连接激酶可改善慢性心力衰竭大鼠心功能[J]．中华心血管病杂志，2014，42(3)：225-229．

[10]Kho C, Lee A, Hajjar RJ. Altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling： targets for heart failure therapy[J]. Nat Rev Cardiol, 2012，9(12):717-733.

[11]曲志刚, 李小鹰. 内质网应激所致炎症的信号转导通路及其在心力衰竭中的作用[J]. 中华老年心脑血管病杂志, 2014，16(6): 662-662.

[12]陈 鹏，杨成明，曾春雨，等.心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌组织内质网应激相关凋亡途径的研究[J].中国病理生理杂志，2010,26(6)：1069-1074.

[13]Hamid T, Guo SZ, Kingery JR, et al. Cardiomyocyte NF-κB p65 promotes adverse remodelling, apoptosis, and endoplasmic reticulum stress in heart failure [J]. Cardiovasc Res, 2011, 89(1):129-138.

[14]Olivetti G, Abbi R, Quaini F, et al. Apoptosis in the failing human heart [J]. N Engl J Med，1997，336(16):1131-1141.

[15]Hayakawa K, Takemura G, Kanoh M, et al. Inhibition of granulation tissue cell apoptosis during the subacute stage of myocardial infarction improves cardiac remodeling and dysfunction at the chronic stage [J]. Circulation, 2003，108(1):104-109.

[16]Nakagawa T, Zhu H, Morishima N, et al. Caspase-12 mediates endoplasmic reticulum specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta[J]. Nature, 2000，403(6765): 98-103.

(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effects of bisoprolol plus peridopril on myocardial endoplasmic reticulum stress in rats with doxorubicin-induced heart failure

WU Jin-bo1, 2, YE Xiao-han2, XIAN Shao-xiang3, DONG Ming-guo2

(1PostdoctoralResearchStation,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China;2DepartmentofCardiology,DongguanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Dongguan523000,China;3DepartmentofCardiology,TheFirstClinicalMedicalHospital，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China.E-mail：wujinbocn@163.com)

AIM: To investigate the effects of bisoprolol (Bis) plus peridopril (Per) on myocardial endoplasmic reticulum stress (ERS) in rats with heart failure．METHODS: Male SD rats were randomly divided into normal control group, sham group, doxorubicin (DOX) group, bisoprolol treatment group (DOX+Bis group), peridopril treatment group (DOX+Per group) and bisoprolol plus peridopril treatment group (DOX+Bis+Per group). A rat model of heart failure was induced by intraperitoneal injection of DOX. Distilled water, bisoprolol, peridopril, and bisoprolol plus peridopril were administrated by gastric gavage for 35 d, respectively. The indexes of cardiac functions and plasma levels of brain natriuretic peptide (BNP) were measured, myocardial apoptosis was analyzed by TUNEL assay and myocardial protein expression of GRP78, CHOP, JNK, caspase-12 and SERCA2a was detected by Western blot.RESULTS: Compared with normal control group and sham group, cardiac output (CO), left ventricular fractional shortening (FS), and left ventricular ejection fraction (EF) of the rats in DOX group decreased significantly (P<0．01), the cardiomyocyte apoptotic index increased significantly (P<0．01), the myocardial protein levels of SERCA2a decreased significantly, and GRP78, CHOP, JNK and caspase-12 increased significantly (P<0.01). Compared with DOX group, CO, FS and EF of the rats in DOX+Bis group, DOX+Per group and DOX+Bis+Per group increased significantly (P<0．01), cardiomyocytes apoptotic indexes in DOX+Bis group, DOX+Per group and DOX+Bis+Per group decreased significantly (P<0．01), myocardial protein levels of SERCA2a in DOX+Bis group, DOX+Per group and DOX+Bis+Per group increased significantly, while GRP78, CHOP, SERCA2a, JNK and caspase-12 decreased significantly (P<0．05). Indicators except JNK in DOX+Bis+Per group were changed more significantly than those in DOX+Bis group or DOX+Per group (P<0．05). CONCLUSION: Bisoprolol plus peridopril therapy improves cardiac functions in a rat model of doxorubicin-induced heart failure with more significant effectiveness than using bisoprolol or peridopril alone, which may be related to inhibition of myocardial ERS and apoptosis.

Bisoprolol; Peridopril; Heart failure; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 1939- 06

2016- 08- 17

2016- 09- 02

541.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.004

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0769-26385087； E-mail: wujinbocn@163.com