缺氧使非洲电鱼小脑浦肯野细胞之间的GABA能突触传递长时程增强*

张月萍， 何海燕, 2， 李 凌， 晋芙丽， 成胜权△

(1 第四军医大学西京医院儿科脑发育研究室，陕西 西安 710032； 2陕西省安康市妇幼保健院新生儿科，陕西 安康 725000)



缺氧使非洲电鱼小脑浦肯野细胞之间的GABA能突触传递长时程增强*

张月萍1， 何海燕1, 2， 李 凌1， 晋芙丽1， 成胜权1△

(1第四军医大学西京医院儿科脑发育研究室，陕西 西安 710032；2陕西省安康市妇幼保健院新生儿科，陕西 安康 725000)

目的：研究急性缺氧对非洲电鱼小脑浦肯野细胞(Pc)之间γ-氨基丁酸(GABA)能突触传递的影响。方法:采用配对全细胞膜片钳记录法，记录电鱼小脑Pc-Pc之间的抑制性突触后电流(IPSC)，观察急性缺氧对Pc-Pc IPSC的影响，以及GABAA受体拮抗剂和谷氨酸α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体拮抗剂对Pc-Pc IPSC缺氧反应的调节作用。结果:短暂缺氧使Pc-Pc IPSC的幅值显著增大，表现为长时程增强(LTP)；GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱逆转了Pc-Pc IPSC的 LTP，表现为长时程抑制；AMPA受体拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)阻断了Pc-Pc IPSC的 LTP，表现为短时程增强。结论:急性缺氧引起电鱼小脑Pc之间的GABA能突触活动持续增强，GABAA受体和AMPA受体共同介导这种反应，提示GABA能和谷氨酸能突触活动的平衡可能是电鱼以及其他缺氧耐受动物缺氧保护反应的关键机制。

缺氧性脑损伤； γ-氨基丁酸； 突触传递； 非洲电鱼； 小脑

缺氧性脑损伤可发生于新生儿期多种疾病过程中，是导致新生儿死亡和小儿神经系统损伤后遗症的主要原因[1]。因此，阐明缺氧性脑损伤的病理机制对开发安全高效的神经保护剂，有效降低新生儿的死亡率和儿童致残率有重要的社会意义。

哺乳类动物脑组织对缺氧非常敏感，缺氧数分钟即可因能量依赖性的离子泵衰竭导致神经元功能障碍或死亡，而缺氧耐受动物却能够在无氧或低氧状态下生存数日或数月[2-5]。因此，研究缺氧耐受动物的缺氧反应特征，是发现缺氧性脑损伤神经保护机制的重要途径。大量研究已证实，缺氧耐受动物应对缺氧的主要策略是降低代谢率[2,4]。由于脑组织消耗的大部分能量被细胞膜上的离子泵用来维持离子运动平衡，因此，降低脑能量消耗的最佳方式，是减少离子跨膜运动，而增强γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)介导的突触抑制是达到这一目的的重要途径之一[3]。来自海龟、硬骨鱼、石蟹等缺氧耐受物种的研究结果表明，在低氧条件下，缺氧耐受动物的GABA水平升高，GABA受体水平上调，强烈提示低氧刺激可能使低氧耐受动物GABA介导的突触活动增强[4-5]。然而，这一推测仍缺乏电生理学证据。因此，本研究在缺氧耐受动物非洲电鱼(mormyrid fish)的脑片上，探讨了小脑环路中主神经元浦肯野细胞(Purkinje cells，Pc)之间的GABA能突触传递效率在急性缺氧刺激下的动态变化。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 实验动物 实验用体长8～12 cm的非洲电鱼，购于西安市西光花卉市场。

1.2 试剂 NaCl、 KCl、 NaH2PO4·H2O、 MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaHCO3、葡萄糖(glucose)、葡萄糖酸钾(K-gluconate)、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、磷酸肌酸二钠(phosphoreatine disodium)、三磷酸腺苷二钠(Na2ATP)、三磷酸鸟苷酸钠(Na3GTP)、KOH均购自Sigma；荷包牡丹碱(bicuculline, BIC)及6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(6-cyano-7-nitro-quinoxaline-2,3-dione, CNQX)购自TORIC。

1.3 溶液 人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)成分(mmol/L)：NaCl 126.0、KCl 5.0、NaH2PO4·H2O 1.25、MgSO4·7H2O 2.0、CaCl2·2H2O 2.0、NaHCO326.0、glucose 10.0，pH 7.35～7.45，渗透压310～320 mOsm/L。电极内液成分(mmol/L)：K-gluconate 120.0、KCl 5.0、HEPES 10.0、EGTA 5.0、CaCl2·2H2O 0.5、MgSO4·7H2O 2.0、phosphoreatine disodium 2.0、Na2ATP 4.0、Na3GTP 0.3，pH 7.35～7.45，渗透压280～290 mOsm/L。

1.4 实验仪器 振动切片机(Leica)；正置显微镜(Ziss)；微电极操纵仪(Sutter Instrument)；放大器、模拟-数字转换器(Axon Instruments)；电极拉制仪(Sutter Instrument)；刺激器(CYGNUS)；渗透压测定仪(FISKE ASSOCIATE)；恒流泵(上海泸西仪器厂)。

2 实验方法

2.1 制备脑片 用三卡因甲磺酸盐(Sigma; 100 mg/L)深度麻醉电鱼，开颅取脑后，迅速投入充以95% O2、5% CO2混合气的0 ℃ ACSF中，约1 min后取出，修整后移入切片槽内固定，用振动切片机切出200 ～ 300 μm厚含小脑尾叶和中央叶的矢状位脑片，立即转移至28 ℃的ACSF中孵育约30 min，移至室温下继续孵育1 h后开始记录。整个过程通以95% O2、5% CO2混合气体。

2.2 配对全细胞膜片钳记录 将脑片移至记录浴槽内，先在低倍镜下确定电鱼脑片尾叶或中央叶的细胞层，再在高倍镜下选择表面光滑、轮廓清晰、立体感强的浦肯野细胞进行配对全细胞膜片钳记录。玻璃微电极充灌内液后电阻为5～8 MΩ。记录过程中使用恒流泵持续向记录浴槽内灌注含95% O2、5% CO2混合气体的ACSF，流速为1.5～2 mL/min。将突触前细胞钳制在电流钳状态下，将突触后细胞钳制在电压钳状态下。向突触前细胞内注射去极化电流(波宽200 ms)，诱发一串动作电位，如果被记录的两个细胞之间有突触联系，则可在突触后细胞上记录到特异的与突触前动作电位相关的突触后电流。调整突触前细胞内注射去极化电流的强度(一般在300～500 pA之间)以获得幅值适中的突触后电流，以0.1 Hz频率记录10 min后，转换充95% N2、5% CO2混合气的ACSF灌流脑片2 min进行急性缺氧处理，然后再恢复95% O2、5% CO2混合气灌流液。所有记录在室温(22～25 ℃)下进行。

3 统计学处理

数据采集使用pCLAMP软件(Axon Instrument)，数据测量使用Clampfit 软件(Axon Instrument)，测量抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic current, IPSC)的峰值，应用Origin 8.0 (Originlab)进行数据处理。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 急性缺氧诱导Pc-Pc IPSC长时程增强(long-term potentiation，LTP)。

在电鱼小脑脑片上用配对全细胞膜片钳记录法记录到的Pc-Pc之间的IPSC如图1所示，突触前Pc的一串动作电位在突触后Pc上引起具有时间相关性的突触后电流，这种突触后电流可被GABAA受体阻断剂BIC完全阻断，表明Pc动作电位在另一Pc上诱发的突触后电流是由GABAA介导的IPSC。

Figure 1.Local neuronal circuitry and patch-clamp recording of Pc-Pc inhibitory postsynaptic current (IPSC). A: schematic representation of the local circuitry within the mormyrid fish cerebellum. Purkinje cells receive excitatory inputs from the parallel fibers and the climbing fibers and inhibitory inputs from the stellate cells and neighboring Purkinje cells. The axons of the Purkinje cell then make synapse onto the efferent cells and neighbouring Purkinje cells. ML: molecular layer; Gal: ganglionic layer; Rrl: granule layer; Grc: granule cell; Mf: mossy fiber; Stc: stellate cell; Efc: efferent cell; Pc: Purkinje cell; IO: inferior olive; CF: climbing fiber. B: an image of a mormyrid cerebellar slice showing the arrangement for Pc-Pc dual cell recording. Rec: recording electrode. C: the evoked action potentials on a presynaptic Pc (Pre. Pc, top trace, representative image) induced IPSC on a postsynaptic Pc (Post. Pc, middle trace, overlay of 10 traces), which was blocked in the presence of bicuculline, a GABAAreceptor antagonist (bottom trace, 10 traces were overlaid).

图1 小脑神经元环路和Pc-Pc IPSC的配对膜片钳记录法

当使用充95% N2、5% CO2混合气的ACSF灌流脑片2 min进行急性缺氧处理后，Pc-Pc IPSC的幅值迅速而显著地增大，并且可稳定地持续1 h以上，即长时程增强，缺氧后的Pc-Pc IPSC 幅值与缺氧之前比较约增加了(63.42±4.22)%(P<0.05)，见图2。

2 GABAA受体拮抗剂完全逆转缺氧引起的Pc-Pc IPSC LTP

为了解GABAA受体在缺氧引起的Pc-Pc IPSC LTP产生中的作用，我们在缺氧处理的同时给予GABAA受体阻断剂BIC。结果发现BIC完全阻断了缺氧引起的Pc-Pc IPSC LTP，并使之逆转为长时程抑制(long-term depression, LTD)，使缺氧后的IPSC 幅值由(100.06±5.34)%降低到(14.28±8.56)%，并持续1 h以上(P<0.05),说明GABAA受体活动增强是缺氧导致Pc-Pc IPSC-LTP产生的重要机制，见图2。

Figure 2. The effects of hypoxia and bicuculline on the inhibitory synaptic transmission between Pcs. A: the IPSC on a Post. Pc induced by the action potentials of a Pre. Pc before and after hypoxia insult； B: GABAAreceptor antagonist bicuculline applied alongside the hypoxic episode depressed the Pc-Pc IPSC compared to the control; C: normalized peak value of Pc-Pc IPSC, plotted as a function of time, showing the potentiation after hypoxia insult was stable and long lasting， and bicuculline reversed the potentiation of IPSC previously induced by hypoxia and caused long-lasting depression of IPSC. The bar indicates the duration of a 2-min hypoxic infusion.

图2 缺氧和bicuculline对浦肯野细胞之间的抑制性突触传递的影响

3 AMPA受体拮抗剂部分阻断缺氧引起的Pc-Pc IPSC LTP

为了解谷氨酸受体活动对缺氧引起的Pc-Pc IPSC LTP的影响，我们在缺氧处理的同时给予谷氨酸α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, AMPA)受体阻断剂CNQX。结果发现CNQX使IPSC幅值在缺氧后出现短暂而显著的增加(即短时程增强，short-term potentiation, STP)，IPSC均值从缺氧前的(99.95±10.87)%增加到(154.79±19.64)%(P<0.05)，在20 min内恢复到接近缺氧前水平，与缺氧后短暂增强的IPSC幅值比，差异有统计学意义，说明AMPA受体活动在缺氧引起的Pc-Pc IPSC LTP中起重要的辅助作用，见图3。

Figure 3.AMPA receptors also contribute to hypoxia-induced LTP of Pc-Pc IPSC. A: in a PC-PC pair, AMPA receptor antagonist CNQX applied alongside the hypoxic episode led to a transitory potentiation of IPSC. Left column: sample traces taken before treatment (control); middle column: sample traces 4～6 min after the onset of hypoxic infusion with 10 μmol/L CNQX; right column: sample traces approximately 20 min after the treatment of hypoxia with 10 μmol/L CNQX. B: normalized peak value of Pc-Pc IPSC. The bar indicates the duration of 2-min hypoxic infusion with 10 μmol/L CNQX. C: the normalized peak values of Pc-Pc IPSC before treatment (a), soon after treatment (b), and 20～70 min after treatment (c), showing that the hypoxia-induced short-term potentiation of IPSC in the presence of CNQX was significant. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsb.

图3 AMPA受体也参与介导缺氧引起的Pc-Pc IPSC LTP

讨 论

电鱼小脑的神经环路在很大程度上与哺乳类动物相似(图1)[6]，小脑主神经元Pc既接受大量兴奋性输入，也接受强大的抑制性输入，是研究抑制性突触活动应对低氧性兴奋毒作用的理想模型[7]；电鱼小脑Pc的轴突末梢终止于其附近的Pc的胞体或近端树突上，与哺乳类动物的小脑相比，能比较容易地在小脑脑片上记录到Pc-Pc之间的抑制性突触后电位，是研究GABA能突触单突触活动的理想模型。正如事先推测的那样，本研究发现急性缺氧使电鱼小脑Pc-Pc之间的 GABA能突触传递发生长时程增强；更有趣的是，这种抑制性突触传递的长时程增强不仅依赖于抑制性氨基酸GABAA受体的介导，同时也需要兴奋性氨基酸AMPA受体的共同作用。

低氧不耐受和低氧耐受动物的脑在常氧条件下的能量消耗率相似[2-3]。低氧驱动的一般模式如能量衰竭、细胞膜去极化、谷氨酸受体过度激活、大量钙离子内流等，在所有脊椎动物的脑是共同的，只是事件发生的时间窗因不同物种体温和代谢率的差异而各有不同[3]。目前公认伴随以去极化的突触传递衰减是低氧敏感的哺乳类动物的脑在低氧条件下发生的最早事件[8]。相对于大鼠等哺乳类动物缺氧时神经元电活动变化的大量研究，低氧耐受动物神经元在低氧时的电生理反应特征较少受到关注。我们以前的工作显示，低氧耐受动物非洲电鱼小脑Pc在短暂缺氧时/后迅速出现长时程超极化(不同于大鼠海马和皮层神经元的典型低氧反应：首先表现为缺氧去极化，继之以缺氧超极化和复氧超极化)，这种超极化可被GABAA受体拮抗剂完全阻断，提示电鱼Pc的缺氧性超极化与GABAA受体介导的抑制性突触活动增强有关[9]，本研究则通过配对全细胞膜片钳记录法证实了这一推测。

本研究的第一个新发现是急性缺氧刺激迅速使电鱼小脑Pc-Pc之间的IPSC长时程增强，这与大鼠皮层和海马GABA能突触传递缺氧时/后迅速衰减截然不同。第二个新发现是GABAA受体和谷氨酸AMPA受体共同介导急性缺氧诱导的电鱼小脑抑制性突触传递的长时程增强。增强GABA介导的抑制性突触活动被认为是缺氧耐受动物在低氧/无氧环境中生存的重要策略[5]，如长期无氧状态下龟脑的GABA受体表达上调[3]，低氧预处理的鲨鱼小脑GABA受体密度增加[10]，说明GABA介导的抑制通路在缺氧耐受动物的低氧/无氧生存中发挥重要作用。本研究中我们观察到GABA能神经元Pc的IPSC在短暂缺氧后表现出的LTP可被GABAA受体拮抗剂bicuculline完全阻断，并逆转为LTD，证实缺氧引起的Pc-Pc IPSC-LTP 是由GABAA受体活动增强引起的，这种Pc-Pc IPSC在缺氧时的长时程增强可能是电鱼小脑保护Pc免受谷氨酸兴奋毒损伤的重要机制。

GABA受体密度在大鼠脑和龟脑是相似的[2]。然而，来自哺乳类动物的大量研究表明短暂缺氧使GABA介导的抑制性突触传递迅速衰减。在大鼠海马脑片上的研究显示GABA介导的IPSC缺氧时迅速衰减[11]；围产期低氧暴露使新生鼠的小脑GABA受体水平下调[12]。这些结果表明哺乳类动物缺氧损伤时抑制性突触传递迅速衰减是脑损伤发生的重要原因。虽然在体外给予GABAA受体激动剂可以抑制缺氧性谷氨酸的过度释放，具有神经保护作用，但补充GABAA受体激动剂用于体内却并未取得理想的神经保护效果[11]。这说明单纯增强抑制性突触活动并不能很好地阻止缺氧性脑损伤的进程。

大量实验结果表明低氧耐受脊椎动物的神经保护机制基本相似：通过兴奋性/抑制性神经传递的平衡而实现[2-3]。本研究发现兴奋性氨基酸AMPA受体活动对Pc-Pc之间IPSC LTP有不可或缺的贡献。AMPA受体拮抗剂的存在使Pc-Pc IPSC 缺氧性增强仅持续了20 min，就逐渐恢复到缺氧前水平，说明缺氧引起的Pc-Pc之间的IPSC-LTP需要AMPA受体介导的兴奋性突触活动的参与。这种参与应是通过小脑环路的整合而发生的。因为Pc接受强大的谷氨酸介导的兴奋性输入，如果阻断了这些兴奋性输入，Pc的兴奋性将下降，而Pc的靶细胞所受到的抑制则减弱。

许多研究结果已表明，在缺氧敏感的哺乳类动物，低氧刺激引起的GABA和谷氨酸系统的变化也密切相关。在体实验显示，外源性GABA和GABA激动剂能抑制大鼠纹状体缺血缺氧性谷氨酸过度释放[13]；另一方面，在大鼠海马脑片上，谷氨酸受体激动剂N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate acid, NMDA)、AMPA均能增强缺氧刺激引起的GABA释放[14]。上述结果强烈提示低氧条件下，GABA介导的抑制性突触传递和谷氨酸介导的兴奋性突触传递有密切的相互联系，这也许是目前在脑保护防治方面，单纯增强GABA能突触活动，或单纯抑制谷氨酸能突触活动都难以达到理想的神经保护作用的重要原因。

综上所述，本研究结果证实耐缺氧动物电鱼小脑Pc 之间由GABAA受体介导的抑制性突触活动在急性缺氧刺激后发生长时程增强，AMPA受体对这种抑制性突触的长时程增强有不可或缺的重要贡献。这一发现表明维持兴奋性突触和抑制性突触传递的适度平衡是防治缺氧性脑损伤的重要策略。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

非病毒、工程化人脂肪间充质干细胞产生BMP4可用于靶向性治疗脑肿瘤并延长患者生存期

允许安全有效的非病毒纳米生物技术应用于基因治疗和细胞治疗是有利的，它可以用于治疗脑肿瘤等严重疾病。人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hAMSCs)显示出高的抗神经胶质瘤的趋向性，可以作为脑肿瘤靶向性治疗的递送载体。Mangraviti 等的研究表明，与销售领先的商业试剂相比，非病毒、可生物降解的聚合纳米颗粒(nanoparticles, NPs)可以用于改变hAMSCs使其具有更高的有效性(75%的细胞)和更高的细胞活力。为了达到研究目的，他们设计了一个聚(β-氨基酯)[poly(beta-amino ester), PBAE]聚合物结构来对hAMSCs进行转染，它比脂质体(LipofectamineTM 2000)具有更高的转染效率；然后评估NP工程化的hAMSCs对骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4, BMP4)的递送能力，在人原发性恶性胶质瘤模型中BMP4通过靶向性治疗癌症复发的来源——人脑肿瘤干细胞(brain tumor initiating cells, BTIC)已被证明是一种的新疗法。该研究结果表明，含有BMP4质粒DNA聚合物纳米颗粒的转基因hAMSCs(BMP4/NP-hAMSCs)分泌BMP4生长因子，从而保持其多向分化潜能及其迁移和侵袭能力。研究还表明，该方法克服了针对脑部治疗的一大挑战——血脑屏障，即NP工程化的hAMSCs经鼻内给药和全身静脉给药后均可以迁移到脑和渗透入脑肿瘤。至关重要的是，与给予GFP/NP-hAMCSs处理的对照组相比，BMP4/NP-hAMSCs滴鼻治疗显著改善了长有人原代BTIC源性肿瘤的无胸腺大鼠的生存率。该研究表明，合成的聚合物纳米颗粒是以干细胞为基础的肿瘤靶向性治疗的一种安全有效的方法。

Biomaterials, 2016, 100:53-66(范冲竹)

LTP of GABAergic synaptic transmission induced by hypoxia in mormy-rid cerebellum

ZHANG Yue-ping1, HE Hai-yan1, 2, LI Ling1, JIN Fu-li1, CHENG Sheng-quan1

(1LaboratoryofBrianDevelopment,DepartmentofPediatric,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2NeonatalUnit,AnkangMaternalandChildHealthHospitalinShaanxiProvince,Ankang725000,China.E-mail:quanyi@fmmu.edu.cn)

AIM: To study the effects of acute hypoxia on GABAergic synaptic transmission between Purkinje cell (Pc) and Pc of mormyrid cerebellum. METHODS: The technique of dual whole-cell patch clamp was used to record the inhibitory postsynaptic current (IPSC) between two Pcs. The responses of Pc-Pc IPSC to acute hypoxic episode were observed. The effects of GABAAreceptor antagonist and glutamate AMPA receptor antagonist on the hypoxic responses of Pc-Pc IPSC were also investigated. RESULTS: Brief exposure to hypoxia led to long-term potentiation (LTP) of Pc-Pc IPSC. The GABAAreceptor antagonist bicuculline completely abolished this LTP, reversed to long-term depression, whereas an AMPA receptor inhibitor CNQX partially prevented the formation of the LTP induced by hypoxia, only displaying a short-term potentiation. CONCLUSION: Acute hypoxia induced LTP of Pc-Pc IPSC, which requires the contribution of both GABAAreceptors and AMPA receptors, indicating that a balance between the GABAergic and glutamatergic activities might be critical to the hypoxia-induced protective response in hypoxia-tolerant animals such as mormyrid fish.

Hypoxia tolerance; γ-Aminobutyric acid; Synaptic transmission; Mormyrid fish； Cerebellum

1000- 4718(2016)11- 1990- 06

2016- 02- 03

2016- 09- 27

国家自然科学基金资助项目(No.30871029)； 第四军医大学西京医院助推计划(No.XJZT10T07)

R338.8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.012

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