IFN-β对沙眼衣原体感染的影响①

杜 昆 李 琦

(湖北省荆州市第一人民医院检验科，荆州434000)



IFN-β对沙眼衣原体感染的影响①

杜 昆 李 琦②

(湖北省荆州市第一人民医院检验科，荆州434000)

目的：研究IFN-β在沙眼衣原体感染细胞中的表达及其对衣原体感染的影响。方法：采用ELISA双抗体夹心法检测衣原体感染细胞培养上清中IFN-β的表达，利用抗人IFN-β抗体中和IFN-β的作用，然后分别用Western blot和免疫荧光技术检测沙眼衣原体感染后衣原体主要外膜蛋白、STAT1蛋白、p-STAT1蛋白和衣原体二次感染滴度变化。结果：沙眼衣原体能诱导宿主细胞表达IFN-β、STAT1蛋白和p-STAT1蛋白，抑制IFN-β的作用能下调STAT1和p-STAT1蛋白表达，同时促进衣原体生长和提高衣原体的二次感染滴度。结论：沙眼衣原体感染能通过诱导宿主细胞分泌IFN-β并上调和活化STAT1蛋白而抑制衣原体生长。

沙眼衣原体；β干扰素；感染

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种严格细胞内寄生的病原菌，可引起人类多种疾病，是沙眼和性传播性疾病的常见病原体，还可导致异位妊娠、早产、不孕等并发症[1-3]。此外，Ct与HIV的感染和肿瘤的发病也有着密切的关系[4-6]。Ct感染人体后，可逃避机体的免疫应答，造成持续性感染。因此，研究机体抗Ct感染的免疫机制具有重要的临床意义。干扰素具有抑制胞内病原微生物感染和复制的作用，主要包括Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)和Ⅱ型干扰素(IFN-γ)。IFN-γ对Ct生长的影响报道较多[7-9]，而IFN-β在Ct感染过程中的作用报道较少。本课题旨在探讨IFN-β在Ct感染细胞中的表达及其对Ct生长的影响，为防治Ct感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 沙眼衣原体L2血清型和HeLa细胞均由中南大学余平教授惠赠；DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；人IFN-β ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；放线菌酮购自Invitrogen公司；兔抗人IFN-β、STAT1和p-STAT1抗体、羊抗MOMP抗体购自Santa Cruz公司；HRP标记的二抗购自武汉博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和Ct增殖 将HeLa细胞接种到50 cm2细胞培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞长成75%融合后，弃培养基，加衣原体悬液，2 h后弃上清，加生长液(含10%胎牛血清和2 mg/L放线菌酮)继续培养，48 h后收集细胞并重悬细胞沉淀，37℃水浴与-80℃反复冻融3次，1 000 r/min离心8 min，上清即为衣原体悬液，分装后-80℃保存备用。

1.2.2 Ct感染 按方法1.2.1培养细胞，然后按照不同实验要求加入不同量的Ct悬液，同时加入或不加入100 μg/ml青霉素或60 μg/ml氯霉素，于不同时间点吸取上清，试剂盒检测上清IFN-β含量。

1.2.3 ELISA双抗体夹心法检测IFN-β 用人IFN-β ELISA试剂盒检测IFN-β。步骤如下：将标准品、待测样本各100 μl加入到预先包被有人IFN-β多克隆抗体的酶标板中，37℃孵育1 h，洗涤5次，每次1 min；加入酶标二抗100 μl，37℃孵育1 h，洗涤5次，每次1 min；加入底物A、B，37℃避光孵育30 min，加终止液50 μl终止反应，450 nm波长下测定各孔OD值，根据标准品OD值制备标准曲线，根据标准曲线和待测样本OD值计算待测样本中人IFN-β含量。

1.2.4 Western blot实验 在6孔板中制备单层HeLa细胞，加入抗人IFN-β抗体，然后加入衣原体悬液，培养48 h后提取细胞总蛋白并检测蛋白浓度，以每孔 80 μg样本上样电泳，转膜；室温5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜3次，每次5 min，加入一抗，4℃孵育过夜，洗膜3次，每次5 min，室温孵育HRP标记的二抗2 h，ECL发光试剂盒检测蛋白条带。

1.2.5 Ct二次感染滴度的测定 按文献[10]测定Ct二次感染滴度，主要步骤如下：在培养的单层HeLa细胞中加入抗人IFN-β抗体和衣原体悬液，感染48 h后收集衣原体；将收集的衣原体作系列稀释后接种到预先放有玻片的24孔板HeLa细胞中，每个稀释度设3个复孔；感染48 h后取出玻片，4%多聚甲醛室温固定20 min，0.1%曲拉通透化4 min，10%山羊血清室温封闭30 min，羊抗MOMP抗体4℃孵育过夜，FITC标记的二抗室温孵育1 h，封片，镜下观察。高倍镜下随机取5个视野共200个细胞进行包涵体记数，计算每孔平均包涵体数(IFU)及Ct原液中Ct浓度(IFU/ml=平均每孔包涵体数×稀释倍数/Ct接种量)。

2 结果

2.1 Ct感染细胞IFN-β表达上调 Ct感染细胞后，于不同时间点检测IFN-β。结果如图1所示，感染0 h IFN-β表达量较低，为6.89 pg/ml；而感染后6、12、24、36和48 h IFN-β表达量分别为46.32、98.51、139.65、201.21和226.78 pg/ml，呈现出随着感染时间延长，IFN-β表达量逐渐增多，且与0 h比较，IFN-β表达变化均具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 Ct的生长促进IFN-β表达 图2A所示，未感染Ct细胞 (0 h) IFN-β表达量较低，为7.06 pg/ml；而0.5、1.0、 1.5和3.0 MOI感染细胞IFN-β表达量分别为58.97、89.78、128.79和198.65 pg/ml，与未感染细胞比较，IFN-β表达变化均具有统计学意义(P<0.05)。图2B所示，Ct感染细胞IFN-β表达量为216.38 pg/ml，在青霉素作用下的Ct感染细胞IFN-β表达量为205.68 pg/ml，二者比较，IFN-β表达变化无统计学意义(P>0.05)；而在氯霉素作用下的Ct感染细胞IFN-β表达量为20.21 pg/ml，与单纯Ct感染细胞比较，IFN-β表达变化有统计学意义(P<0.05)。

2.3 加入抗IFN-β抗体促进衣原体生长 图3A所示，Ct感染细胞可检测到MOMP蛋白表达(第2道)，加入抗IFN-β抗体后，MOMP蛋白表达量明显增多(第3道)。图3B所示，未加抗IFN-β抗体时，Ct二次感染滴度为6.8 IFU/ml(log10)，而分别加入5、10和20 μg/ml抗IFN-β抗体时，Ct二次感染滴度为8、10.1和12.3 IFU/ml(log10)，与未加抗IFN-β抗体感染细胞比较，Ct二次感染滴度变化有统计学意义(P<0.05)。

图1 Ct感染HeLa细胞IFN-β表达Fig.1 Expression of IFN-β in Ct-infected HeLa cells

图2 Ct的生长促进IFN-β表达Fig.2 Ct growth promote expression of IFN-β

图3 抗IFN-β抗体促进衣原体生长Fig.3 Anti-IFN-β antibody promote Ct growth

图4 抑制STAT1蛋白表达与活化促进衣原体生长Fig.4 Inhibition of STAT1 expression and activity promote Ct growth

2.4 Ct感染细胞通过诱导IFN-β分泌上调并活化STAT1蛋白 图4所示，与正常细胞对照组相比，Ct感染细胞STAT1和p-STAT1蛋白表达明显上调(第2道)，加入抗IFN-β抗体后，STAT1和p-STAT1蛋白表达量明显减少，同时MOMP蛋白表达量明显增多(第3道)。外源性IFN-β单独作用于HeLa细胞，STAT1和p-STAT1蛋白表达也明显增多(第4道)。

3 讨论

衣原体感染可诱导宿主发生免疫应答，主要以巨噬细胞和T细胞介导的细胞免疫为主。致敏的CD4+T细胞能释放多种细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10[11，12]，同时能激活巨噬细胞，从而抑制衣原体的增殖。其中IFN-γ是机体抗衣原体感染的一个重要的细胞因子，它可以通过诱导宿主细胞产生NO[9]，而NO作为一种免疫效应分子可介导细胞毒作用而抑制或杀死细胞内寄生物。有文献报道，Ct感染后也可诱导宿主细胞产生IFN-β[13，14]，但IFN-β在宿主防御Ct感染中的作用并不十分清楚。

本研究中，我们利用Ct L2血清型感染HeLa细胞，ELISA双抗体夹心法检测Ct感染细胞培养上清中是否含有IFN-β。结果证实，Ct感染不但能诱导宿主细胞产生IFN-β，并且随着感染时间的延长，IFN-β表达量也逐渐增多，表明Ct感染能诱导宿主细胞表达IFN-β。为进一步证实Ct的生长与IFN-β表达的关系，我们用不同剂量的Ct感染细胞，结果表明随着感染剂量的增加，IFN-β的表达也逐渐增多；此外，我们进一步用100 μg/ml青霉素和60 μg/ml氯霉素的作用于Ct感染细胞，然后检测IFN-β表达，结果证实青霉素并不影响Ct感染细胞IFN-β的表达，而氯霉素能明显减少感染细胞IFN-β的表达。虽然青霉素能抑制衣原体RB复制和RB向EB的转化，但不影响衣原体蛋白合成，而氯霉素能抑制衣原体蛋白合成，表明IFN-β表达依赖于Ct生长。

为研究IFN-β对Ct生长的影响，我们事先在Ct感染之前加入抗人IFN-β抗体，以中和Ct感染诱导产生的IFN-β作用，然后用两个不同的实验证实IFN-β对Ct的生长影响。首先，我们检测当IFN-β作用被抗体中和后MOMP表达情况，因为MOMP是衣原体菌体蛋白，能很好反映Ct的生长情况，结果表明当IFN-β作用被抗体中和后，MOMP蛋白的表达量增多；其次，通过检测Ct的二次感染滴度，进一步证实了IFN-β作用被抗体中和后对Ct活性的影响，结果表明随着抗人IFN-β抗体浓度的逐渐增加，Ct二次感染滴度也逐渐升高，未加抗人IFN-β抗体时，其感染滴度最低，结果证实IFN-β具有抑制体外Ct生长的作用。由于IFN-β可以影响细胞多个基因表达，如IFN-β可以上调人成纤维细胞STAT1、STAT2和IRF9蛋白表达[15]。Lad等[14]报道衣原体感染细胞能通过上调STAT1蛋白表达而抑制衣原体生长，而有活性的STAT1蛋白以磷酸化形式存在。为证实IFN-β对Ct生长抑制作用是否与STAT1和p-STAT1蛋白表达有关，我们检测了沙眼衣原体感染细胞STAT1 和p-STAT1蛋白表达情况。结果发现Ct感染细胞STAT1和 p-STAT1蛋白表达明显上调，加入抗IFN-β抗体后，STAT1和 p-STAT1蛋白表达量明显减少，同时MOMP蛋白表达量明显增多。外源性IFN-β单独作用于HeLa细胞，STAT1和 p-STAT1蛋白表达也明显增多。以上研究结果表明，沙眼衣原体感染细胞可能主要通过诱导IFN-β分泌并上调和活化STAT1蛋白而抑制衣原体生长。

综上所述，Ct感染细胞不但能表达IFN-β，而且能通过IFN-β诱导STAT1蛋白表达而抑制Ct的增殖，这可能是宿主细胞防御Ct感染的机制之一。

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[收稿2016-01-12 修回2016-02-12]

(编辑 许四平)

Effect of IFN-β on Chlamydia trachomatis infection

DU Kun, LI Qi.

Department of Clinical Laboratory,the First People′s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China

Objective:To investigate the expression of IFN-β in Chlamydia trachomatis-infected cells and the effect of IFN-β on Chlamydia trachomatis infection. Methods: IFN-β was examined in Chlamydia trachomatis-infected cells culture supernatant with ELISA double antibody sandwich method.Chlamydia trachomatis major outer membrane protein,STAT1 protein and p-STAT1 and infectious titers were detected by using Western blot and immunofluorescence assays,respectively,after the IFN-β was neutralized by IFN-β antibody. Results: Chlamydia trachomatis infection could induce IFN-β and STAT1 protein and p-STAT1 expression.Inhibition the activity of IFN-β could down-regulated the expression of STAT1 and p-STAT1 protein,moreover,promotes Chlamydia trachomatis growth and secondary infectious titers.Conclusion: Chlamydia trachomatis growth were inhibited by IFN-β in a STAT1-dependent fashion in infected cells.

Chlamydia trachomatis;IFN-β;Infection

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.020

杜 昆(1972年-)，男，博士，副主任技师，主要从事抗感染免疫方面的研究。

R374+1

A

1000-484X(2016)11-1657-04

①本文为湖北省卫生厅青年科技人才项目(QJX 2012-46)。

②通讯作者，E-mail: liqijzhyy@163.com。