KLF9和KLF15在维吾尔族网膜脂肪中的表达及其与炎症相关性分析①

王翠喆 哈晓丹 谢建新 许 彭 李 伟 张 君

(石河子大学医学院新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，石河子832000)



KLF9和KLF15在维吾尔族网膜脂肪中的表达及其与炎症相关性分析①

王翠喆 哈晓丹 谢建新 许 彭 李 伟②张 君

(石河子大学医学院新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，石河子832000)

目的：检测维吾尔族网膜脂肪组织KLF9及KLF15 mRNA表达水平，分析KLF9、KLF15与炎症信号通路关键因子的相关性。方法：选取维吾尔族个体NC组50例、OB组45例，检测一般资料和生化指标。采集网膜脂肪组织，RT-PCR法检测KLF9、KLF15及NF-κB炎症信号通路关键因子mRNA表达水平。结果：OB组BMI、WC、HC、WHR、TG和LDL显著高于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。维吾尔族网膜脂肪组织中，OB组NF-κB、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平显著高于NC组(P<0.05)，NF-κB mRNA表达与体重和TG显著正相关(P<0.05)，TNF-α mRNA表达与TG和TC显著正相关(P<0.05)，IL-6 mRNA表达与HC、TG和LDL显著正相关(P<0.05)；OB组网膜脂肪组织KLF15 mRNA表达水平显著低于NC组(P<0.05)，与BMI、WC、WHR显著负相关(P<0.05)，与HDL正相关，与TG负相关。KLF9 mRNA表达水平高于NC组，与NF-κB显著正相关(P<0.01)，与IL-6正相关。结论：KLF15可能通过调控脂代谢发挥抗炎作用；肥胖状态下脂代谢紊乱可能间接上调KLF9的表达，而KLF9作为转录激活因子可能通过调控下游炎症因子的转录活性，从而促进炎症因子的表达和释放。

维吾尔族；网膜脂肪组织；KLF9；KLF15；炎症

肥胖已成为世界性的健康问题。当前认为，肥胖是一种慢性炎症状态，该状态与肥胖发生时脂肪细胞的脂解增加、血液游离脂肪酸水平(Free fatty acid,FFA)升高密切相关[1]，并且可以诱发多种慢性疾病。脂肪组织作为全身炎症反应的始发部位，在机体能量代谢的调节方面起重要作用，但肥胖启动炎症发生的具体分子机制并不十分明确。

Kruppel 样因子(Kruppel-like factors,KLFs)是一类具有锌指结构的转录因子,其典型结构特征是在其羧基端具有3个C2H2锌指结构[2]，广泛参与细胞增殖、分化和胚胎发育等多个生命活动的调控。有文献报道， KLF9和KLF15在调控脂代谢过程中发挥重要作用，而脂代谢紊乱是引发炎症的关键因素[3，4]。因此，KLF9和KLF15可能参与脂肪组织炎症反应。

为此，本研究采集维吾尔族网膜脂肪组织，检测KLF9及KLF15 mRNA表达水平，分析KLF9、KLF15与炎症信号通路关键因子的相关性，为阐明肥胖始动炎症的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2012年10～12月及2013年4～9月新疆喀什地区人民医院腹部择期手术的维吾尔族个体95例，手术前收集一般资料；检测血糖、血脂水平。将研究对象分为正常(Normal control,NC) 组(18.5 kg/m2≤BMI≤24 kg/m2) 50例、肥胖(Obesity,OB)组(BMI≥28 kg/m2) 45例。排除标准：糖尿病(Diabetes mellitus,DM)、肿瘤、急性炎症、肝肾疾病及近期服用可能干扰糖脂代谢药物者。本研究方案经医学伦理委员会批准(No.2014LL22)，研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样本收集 各组于手术前1 d测量腰围(Waist circumference ,WC)、臀围(Hip circum-ference,HC)、腰臀比(Waist-to-hip ratio,WHR)、收缩压(Systolic blood pressure,SBP)、舒张压(Diastolic blood pressure,DBP)、体质指数(Body mass index,BMI)。手术当日开腹后严格无菌操作取网膜脂肪组织，约3 cm×3 cm，液氮冻存，标记住院号、姓名、性别。

1.2.2 生化指标测定 葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG)、总胆固醇(Total cholesterol ,TC)、甘油三酯(Triglyceride ,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein ,HDL)和低密度脂蛋白(Low density lipoprotein ,LDL)均用全自动生化分析仪检测。

1.2.3 RT-PCR检测mRNA表达水平 取脂肪组织300 mg，Trizol法提取网膜脂肪组织总RNA[5]，实时定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测mRNA表达水平。实时定量PCR仪购自美国ABI公司，型号ABI7500 Fast。PCR反应体系为20 μl：RNase-free水7 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，SYBR Select Master Mix 10 μl，cDNA 2 μl。反应条件为：经94℃ 30 s预变性后，95℃变性5 s，60℃ 34 s，40个循环。扩增引物序列及目的片段长度见表1。表达量以目的基因与内参GAPDH比值表示，内参GAPDH拷贝数为1。

表1 各引物序列

Tab.1 All kinds of primer sequences

GeneSequenceIDPrimernamePrimer(5′⁃3′)Fragment(bp)KLF9NM＿0012062KLF9⁃FTGGCTGTGGGAAAGTCTATGG124KLF9⁃RCTCGTCTGAGCGGGAGAACTKLF15XM＿0052474002KLF15⁃FGGTACGGCTTCACACCTGAG150KLF15⁃RACACCAAAAGCAGCCACCTNF⁃κBXM＿0115320091NF⁃κB⁃FCTGAGTCCTGCTCCTTCCA103NF⁃κB⁃RCTTCGGTGTAGCCCATTTGTTNF⁃αNM＿0005943TNF⁃α⁃FGTGACAAGCCTGTAGCCCAT111TNF⁃α⁃RTATCTCTCAGCTCCACGCCAIL⁃6XM＿0115153901IL⁃6⁃FCCTTCGGTCCAGTTGCCTTC105IL⁃6⁃RGTGGGGCGGCTACATCTTTGGAPDHNM＿0012567991GAPDH⁃FGGTGGTCTCCTCTGACTTCAA211GAPDH⁃RTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCT

2 结果

2.1 一般资料及生化指标比较 OB组体质量、WC、HC、WHR、BMI、TG和LDL显著高于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.2 网膜脂肪组织炎症信号通路关键基因mRNA表达水平 在网膜脂肪组织中，OB组KLF9 mRNA表达水平高于NC组；NF-κB、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平显著高于NC组(P<0.05)；而OB组KLF15mRNA表达水平显著低于NC组(P<0.05),见图1。

表2 各组一般资料和生化指标比较

Tab.2 Comparison of data and biochemical indicators of two groups

TestingindexNCOBCasenumber5045Age4742±17394594±1001Weight(kg)6308±7747996±11102)WC(cm)8962±152911242±8562)HC(cm)9340±86410623±18232)WHR096±016107±0082)BMI2292±2543156±3132)SBP(mmHg)12052±226112974±2095DBP(mmHg)8028±15208282±1417FPG(mmol/L)50±085500±072TG(mmol/L)260±143376±1892)TC(mmol/L)487±120508±103LDL(mmol/L)264±080302±0771)HDL(mmol/L)122±047145±080

Note：ttest,1)P<0.05,2)P<0.01 the difference between NC and OB group was statistically significant.

图1 炎症信号通路关键基因mRNA表达水平Fig.1 Key gene mRNA expression level of inflammatory signaling pathwaysNote: t test.*.P<0.05,**.P<0.01 the difference between NC and OB group was statistically significant.

2.3 相关性分析

2.3.1 一般资料和生化指标与炎症因子相关性分析 维吾尔族网膜脂肪组织NF-κB mRNA表达与体重和TG显著正相关(P<0.05)；TNF-α mRNA表达与TG和TC显著正相关(P<0.05)；IL-6 mRNA表达与HC、TG和LDL显著正相关(P<0.05)，见表3。

2.3.2 KLF9与炎症因子相关性分析 在网膜脂肪组织中，KLF9 mRNA表达与NF-κB显著正相关(P<0.01)，与IL-6正相关，见图2。

2.3.3 一般资料和生化指标与KLF15相关性分析 在网膜脂肪组织中，KLF15 mRNA表达与BMI、WC、WHR显著负相关(P<0.05)，与HDL正相关，与TG负相关，见图3。

表3 一般资料和生化指标与炎症因子相关性

Tab.3 Correlation of general data,biochemical indexes and inflammatory factor

CorrelationNF⁃κBrPTNF⁃αrPIL⁃6rPBMI021200540173011601770117Weight02391)00300162014201710129WC018800890051064602110060HC021600500191008202751)0013WHR01090355-0135022400960428TG02581)002602281)003803422)0004TC0124031702291)004701900136HDL-0209007400990371-00790517LDL009804050162014403001)0012

Note：Pearson analysis,1)P<0.05,2)P<0.01 the correlation between general data，biochemical indexes and the mRNA expression level of inflammatory factor has statistical significance.

图2 KLF9与炎症信号通路关键因子相关性Fig.2 Correlation of KLF9 and inflammatory signaling pathways critical factors Note: Pearson analysis,the correlation between the two factors has statistical significance.

图3 一般资料和生化指标与KLF15相关性Fig.3 Correlation of general data,biochemical indicators and KLF15Note: Pearson analysis,the correlation between the two factors has statistical significance.

3 讨论

肥胖是一种慢性炎症状态，与多种代谢紊乱密切相关，包括胰岛素抵抗和2型糖尿病[5]。肥胖导致的脂代谢紊乱是引发炎症的关键，而其具体机制并不十分明确。有研究报道，新疆地区哈萨克族和维吾尔族人群超重或腹型肥胖的患病率均已超过40%，且显著高于汉族人群[6]。在相同的BMI水平下，维吾尔族个体腰臀比和糖尿病的患病率显著高于哈萨克族个体[7]。此外，维吾尔族有更多的网膜脂肪，而哈萨克族个体有更多的皮下脂肪[7]。腹型肥胖个体更容易患糖尿病和心血管疾病等慢性代谢性疾病[8]。因此，本研究采集维吾尔族网膜脂肪组织，检测KLF9、KLF15及炎症信号通路关键因子mRNA表达水平，分析KLF9、KLF15与炎症相关性。

在骨骼肌细胞中，KLF15调控脂的摄取和利用。在脂肪细胞中，TNF-α能够显著降低KLF15的表达水平，并且干扰KLF15后能够显著抑制抗炎性脂肪细胞因子Adipolin的表达水平[3]。最新研究报道，在小鼠颈总动脉原位移植和饮食诱导的动脉粥样硬化模型中，KLF15能抑制依赖P300的P65活性，减弱P65与MCP-1和VCAM-1启动子区的结合能力，从而发挥抗炎的作用[9]。本研究结果表明，OB组KLF15 mRNA表达水平显著低于NC组，而炎症因子NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平显著高于NC组，提示KLF15可能发挥抗炎作用。相关性分析结果表明，KLF15与BMI、WC和WHR均显著正相关，与HDL正相关，与TG负相关，KLF15与炎症因子NF-κB、TNF-α及IL-6则无显著相关性，而血脂代谢异常与网膜脂肪组织炎症因子mRNA水平显著正相关。以上结果提示，肥胖状态下，KLF15的表达抑制可能导致了脂代谢紊乱，继而促进了脂肪组织炎症因子的表达和释放。而肥胖状态下KLF15表达抑制的具体机制有待进一步研究。

KLF9最初发现与脂肪细胞分化相关，既有转录抑制活性，又具有转录激活活性[10]。但KLF9与脂肪组织炎症的关系尚未报道。有文献表明，在巨噬细胞中KLF9能够抑制糖皮质激素诱导的抗炎性因子KLF2的表达水平[10]。本研究结果表明，维吾尔族网膜脂肪组织OB组KLF9 mRNA表达水平高于NC组，且KLF9与炎症因子NF-κB和IL-6正相关。此外，KLF9与血脂水平并无显著相关性，与KLF15恰好相反。提示，肥胖状态下脂代谢紊乱可能间接上调KLF9的表达，而KLF9作为转录激活因子可能通过调控下游炎症因子的转录活性，从而促进炎症因子的表达和释放。TLRs样受体(Toll-like receptors，TLRs)是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，在先天性免疫反应的炎症信号通路中有重要作用，而脂肪细胞炎症因子的释放与FFA水平升高导致的TLRs/NF-κB 信号通路激活有关[11]。在肥胖始动炎症过程中，是否高的血脂水平通过影响TLR4信号通路，进而促进KLF9的表达有待进一步研究。

综上所述，KLF15可能通过调控脂代谢发挥抗炎作用；肥胖状态下脂代谢紊乱可能间接上调KLF9的表达，而KLF9作为转录激活因子可能通过调控下游炎症因子的转录活性，从而促进炎症因子的表达和释放。

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[收稿2015-12-28]

(编辑 倪 鹏)

KLF9,KLF15 expression in omental adipose tissue and correlation with inflammatory of an Uygur population

WANG Cui-Zhe,HA Xiao-Dan,XIE Jian-Xin,XU Peng,LI Wei,ZHANG Jun.

The Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Medical College of Shihezi University,Shihezi 832000,China

Objective:To detect KLF9 and KLF15 mRNA expression of the omental adipose tissue,and analyze the relationship between KLF9,KLF15 and inflammatory in an Uygur population.Methods: The Uygur subjects were selected and divided into NC group (n=50) and OB group (n=45).The mRNA level of KLF9,KLF15 and the critical factors of NF-κB inflammatory signaling pathways were detected by RT-PCR.Results: Compared with NC group,the level of BMI,WC,HC,WHR,TG and LDL were significantly higher in the OB group(P<0.05);the mRNA level of NF-κB,TNF-α and IL-6 were significantly higher in the OB group(P<0.05);NF-κB mRNA expression level was significantly positive correlated with weight and TG(P<0.05);TNF-α mRNA expression level was significantly correlated with TG and TC;IL-6 mRNA expression level was significantly correlated with HC,TG and LDL(P<0.05).The KLF15 mRNA expression level of the omental adipose tissue in OB group was significantly higher than the NC group(P<0.05);and significantly positive correlated with BMI,WC and WHR (P<0.05),positive correlated with HDL,while negative correlated with TG.Conclusion: KLF15 probably plays the important role of anti-inflammatory by regulating lipid metabolism;under the obesity condition,Lipid metabolism disorders may indirectly increase KLF9 expression,and KLF9 may be act as an activating transcription factor to promote the expression and release of inflammatory cytokines through regulating the transcription activity of inflammatory factors downstream.

Uygur;Omental adipose tissue;KLF9;KLF15;Inflammation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.019

王翠喆(1992年-)，女，硕士，主要从事分子遗传学方面研究，E-mail：wangcuizhe905@163.com。

及指导教师：张 君(1979年-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事肥胖、炎症及代谢相关性疾病的发病机制研究，E-mail:zhangjunyc@163.com。

R34

A

1000-484X(2016)11-1653-05

①本文为兵团应用基础研究计划(2015AG016)、石河子大学重大科技攻关计划项目(gxjs2012-zdgg02)、石河子大学高层次人才科研启动资金专项(RCZX201230)和石河子大学大学生研究训练计划(SRP2015246)。

②同时就职于石河子大学医学院第一附属医院检验科，石河子832000。