银杏叶提取物对家兔凝血功能的影响研究

唐志苗 倪一鸣

银杏叶提取物对家兔凝血功能的影响研究

唐志苗 倪一鸣

目的 通过观察银杏叶提取物（Egb761）注射液对家兔血小板计数（PLT）、血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板第3因子（PF3aT）的作用，从而探讨Egb761对家兔凝血功能的影响。方法 24只家兔随机分成对照组（耳缘静脉注射0.9%氯化钠注射液0.3ml/kg），小剂量组（耳缘静脉注射Egb761 0.3ml/kg），中剂量组（耳缘静脉注射Egb761 1.5ml/kg），大剂量组（耳缘静脉注射Egb761 3.0ml/kg），每组6只（雌雄对半），连续给药1周（7d），于给药的第7天静脉注射Egb761后1.5h自耳缘动脉采血5ml，检测PLT、PT、APTT、PF3aT等指标。结果 Egb761对正常家兔的PT、APTT、PLT均无影响（均P＞0.05），但影响PF3aT，使用PF3aT的第3管较第4管延长（P＜0.05）。结论 Egb761通过影响血小板活化，进而影响PF3aT，导致机体凝血功能缺陷，使机体处于易出血状态，从而可能影响家兔的抗凝治疗。

银杏叶提取物注射液 家兔 凝血功能

从银杏叶中提取出有药用成分的化合物主要为黄酮类及银杏内脂等，简称为银杏叶提取物（ginkgo biloba extract，Egb761），在临床上已广泛应用。但有报道Egb761本身或与华法林联用有增加出血的危险[1],但其具体机制尚不明确。本文通过动物实验的方法，观察Egb761对血小板计数（PLT）、血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板第3因子（PF3aT）有效性试验的影响，报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 新西兰大白兔，雌雄各半，体重1.9～2.1（2.16±0.13）kg，购于金华市药检所，合格证号：SYCXK（浙）2006-0024。

1.2 药物、试剂和仪器 Egb761注射液（金纳多）为5ml/支,含Egb761 17.5mg，其中含银杏黄酮4.2mg，德国威码舒培博士药厂生产；华法林钠片：3.0mg/片，芬兰Orion Corporation公司提供；PT试剂（意大利IL公司生产）；APTT试剂（意大利IL公司生产）；40g/L白陶土悬液（以9g/L氯化钠作为溶剂）；0.025mol/L氯化钙溶液。XE-2100全自动血液分析仪（日本SYSMEX公司产品）及原装配套试剂；广州阳普医疗用品有限公司提供的血凝试管（109mmol/L柠檬酸钠1∶9）；AL-9000全自动血凝分析仪（意大利IL公司产品）；水浴恒温箱；秒表。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及干预措施 新西兰大白兔24只，由专业饲养人员同一批全价营养颗粒饲料喂养，并保持饲养及实验场所温度17～25℃，相对湿度40%～70%。随机分为4组，分别为对照组及Egb761大、中、小剂量组，每组各6只，雌雄各半。各组动物先耳缘静脉注射给药，Egb761小、中、大剂量组分别注射Egb761注射液（0.3、1.5、3.0ml/kg，约相当于人的剂量1、5、10倍）；对照组注射0.9%氯化钠注射液（0.3ml/kg），连续给药1周（7d），于给药的第7天静脉注射Egb761后1.5h自耳缘动脉采血5ml，检测PLT、PT、APTT、PF3aT等指标。

1.3.2 标本的处理和监测 用真空采集法从兔耳缘动脉直接采血至专用血凝试管，血常规试管各1份；PT、APTT按操作规程在AL-9000全自动血凝分析仪上检测；PLT按操作规程在XE-2100全自动血液分析仪上检测；PE3aT有效性测定，严格按《全国临床检验操作规程》进行[2]。

1.3.2.1 富血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆（PPP）的制备 自清醒新西兰大白兔耳缘动脉真空取血，以109mmol/L柠檬酸钠1∶9抗凝收集于血凝试管中的血，于室温经1 800r/min离心10min，所得血浆即为PRP；剩余血液再以4 000r/min离心10min，上层液即为PPP作为测定时调零或用于调整PRP中的PLT及实验过程中，PRP中的PLT调整至约500×109/L。

1.3.2.2 PF3aT测定注意事项 真空采血顺利并立即分离血浆；PRP中PLT调至（540±20）×109/L，PPP中PLT调至（10～20）×109/L，避免红细胞混入；标本测定前所用的器材均为凝血专用器材，测定时的试管用洁净玻璃试管；40g/L白陶土悬液使用前充分混匀，白陶土加入标本后，标本在孵育期也混匀数次；每组测定2次，取平均值。

1.3.2.3 PF3aT测定步骤 取4支小试管分4组，按表1每管加入PRP和PPP各0.1ml。将上述4支试管置37℃水浴预温2min后从第1管起依次每隔2min加0.2ml白陶土悬液；记录加入白陶土的时间，20min后一次加入0.2ml浓度为0.025mmol/L的氯化钙溶液，同时启动秒表测定凝固时间。

表1 PF3aT测定的试管分组

1.3.2.4 PF3aT测定结果判断 第3组、第4组分别为待测者和正常对照管，第1组较第2组凝固时间延长5s以上为异常，见于PF3aT减低；PF3aT有缺陷或内源凝血因子有缺陷时第3组凝固时间比第4组长。

1.4 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

本组实验中未发现所实验家兔有明显出血症状。

2.1 各组兔静脉注射Egb761后PT、APTT及PLT变化比较 见表2。

表2 兔静脉注射Egb761后PT、APTT及PLT变化

由表2可见，各组间两两比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2各组兔静脉注射Egb761后PF3aT值变化比较 见表3。

表3 兔静脉注射Egb761后PF3aT值变化

由表3可见小、中、大剂量组第1管凝固时间与第2管比较差异无统计学意义（P＞0.05），而第3管凝固时间比第4管显著延长（P＜0.01），但不同组间凝固时间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 兔静脉注射Egb761后对PF3aT的值不同管间差值比较 见表4。

表4 兔静脉注射Egb761后PF3aT不同管间差值比较

由表4可见，两组第1管与第2管差值差异无统计学意义（P＞0.05）；两组第3管与第4管差值差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

银杏叶作为我国传统中医药的药用植物，治疗哮喘和和支气管炎，已有悠久的历史。而今，其通过现代加工技术将银杏叶有效成分加以分离、富集而获得的标准制剂，称之为Egb761（其中含有24%的黄酮，6%萜内酯类，另70%由酚类、氨基酸等组成），广泛应用于临床。十余年来，大量的研究表明，Egb761首先可以作为一种天然的还原剂，用以清除机体内过多的自由基。如银杏黄酮可以清除O2、OH、NO等自由基，银杏苦内酯A则可以减少自由基的形成，从而抑制细胞膜脂质的过氧化反应，防止自由基对机体造成的一系列伤害。此外Egb761尚可以降低全血黏稠度，改善血液流变学指标[3]；调节循环系统，维持动静脉张力等作用。因此Egb761已广泛应用于临床各科，尤其是用于治疗脑部血液循环障碍所致疾患[4]，如中风、记忆力减退、痴呆等。近几年研究发现，Egb761同样可以用于保护心肌缺血再灌注损伤[5]；预防心肌缺血再灌注后心率失常的发生[6]。已有学者将Egb761用于心脏外科的临床治疗，对体外循环后心脏功能的恢复起到了积极的作用。

但近年来不断有Egb761引起出血的报道[7]。并建议患有心脏病、脑梗死、各种血栓症并且在服用华法林等抗凝药物的时候，应尽量避免同时使用Egb761[8]。Egb761本身或与华法林联用有增加出血的危险，但其具体机制尚不清楚；Egb761是否会使机体处于易出血状态，引起出血并发症，也尚存在争议[9]。这使得我们在临床工作中，对于是否将Egb761用于换瓣术前、术后的辅助治疗，一直心存顾虑。因此，我们试图用动物实验的方法，观察Egb761对凝血功能有无影响。

本研究结果表明，Egb761对兔凝血功能有影响。文中表2提示大、中、小剂量Egb761均对PLT、PT、APTT均无影响，这与文献报道相吻合[10]。但表3、4提示Egb761对PF3aT有影响，第3管值大于第4管（正常值），但不同剂量Egb761对PF3aT作用差异无统计学意义。提示Egb761能使机体处于凝血功能缺陷状态，机体容易出血。

凝血因子相互作用需要磷脂表面。磷脂表面来自PF3，也来自组织因子（TF）。没有PF3aT和TF这两个磷脂表面，凝血过程就无法进行。PF3aT是在血小板活化过程中的产物，为凝血因子提供活化所需的磷脂表面[11]，而Egb761中银杏内酯是血小板活化因子（PAF）的拮抗剂[12]，故Egb761可通过影响血小板功能活化而使PF3aT减少，进而使为凝血提供催化所需的磷脂表面的有效面积减少，吸附并激活的凝血因子（Ⅱ、Ⅹ）也相应减少。另外，血小板内容物中包含有种类较多的凝血因子也在活化时一同释放出来,这样Egb761通过影响血小板功能活化最终使血液凝固减慢，导致凝血功能缺陷，使机体处于易出血状态。表现为对PF3aT有影响，即第3管值大于第4管（正常值）。这与沈连忠等[13]报道相符。由于Egb761只影响血小板活化，故对PLT、PT、APTT无影响。

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Effect of Ginkgo bibola leave extract on coagulation function of rabbits

TANG Zhimiao,NI Yiming.Department of Thoracic Surgery, Jinhua Municipal Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the effect of extract of Ginkgo bibola leaves(Egb)on coagulation function of rabbits. Methods Twenty four rabbits were randomly divided into low,medium,high-dose Egb groups and control group with 6 in each group.Intravenous infusion of 0.3ml/kg NS was given to the rabbits in control group,and 0.3ml/kg,1.5ml/kg,3ml/kg Egb761 were given to the rabbits in low,medium and high-dose Egb groups for 7d.After 1.5h of injection on d7,the blood samples were collected,and PLT,PT,APTT,PF3aT were examined. Results There were no significant differences in PLT,PT,APTT between control group and Egb761 groups(P＞0.05),while the PF3aT time in Egb761 groups was prolonged(P＜0.05). Conclusion Egb761 can affect platelet factor 3 and hinder the activation of platelet,leading to coagulation disorder in rabbits.

Injection ofginkgo bibola leaves extractRabbitCoagulation

2015-12-21）

（本文编辑：田云鹏）

321000 金华市中心医院心胸外科（唐志苗），浙江大学医学院附属第一医院心胸外科（倪一鸣）

唐志苗，E-mail：tangzhimiao@163.com