冠脉旁路移植术患者血小板microRNAs的激活与血小板功能的研究

陈 良，吕 琳，龙 村，楼 松

·临床研究·

冠脉旁路移植术患者血小板microRNAs的激活与血小板功能的研究

陈 良，吕 琳，龙 村，楼 松

目的 观察冠状动脉旁路移植术（CABG）患者血小板microRNAs和血小板功能的变化，对比体外循环（CPB）和非体外循环（off－pump）对凝血功能、血小板microRNAs的影响，并了解其与转机时间的关系。方法 2015年8月至2015年9月50例CABG患者入组，分为CPB组和off－pump组，排除标准为：急诊手术、二次手术、CABG合并其他手术、肝、肾和血液系统慢性疾病；记录患者术前基本资料。选取麻醉诱导后（T1）、鱼精蛋白中和5 min后（T2），采用常规实验室方法测定血常规；用快速血栓弹力图仪行凝血功能检测；RT－PCR技术检测miR－223和miR－126基因的表达。结果 50例患者，两组各25例。T2相比于T1，两组的血小板计数、血红蛋白均明显下降，但off－pump组下降幅度小，且两组存在显著性差异（P＝0．030，P＜0．001）；鱼精蛋白中和后，两组血小板功能均下降，但中位数都在正常范围内，两组之间无统计学差异（P＝0．073）。与术前相比，miR－223和miR－126鱼精蛋白中和后均明显增高，且CPB组升高更明显（P＜0．001）。鱼精蛋白中和后血凝块强度最大振幅与转机时间呈现直线关系（r＝0．64，P＝0．008）。结论 CPB和off－pump鱼精蛋白中和后血红蛋白、血小板计数和血小板功能均明显降低，但对血小板功能影响相对较小，血小板功能随着转机时间延长而代偿性增高，与血小板激活水平变化趋势并不同步。

冠状动脉旁路移植术；体外循环；microRNAs；血小板功能

冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）包括体外循环（cardiopulmonary by⁃pass，CPB）和非体外循环（off－pump）两种，其利弊一直存在争议［1］。后者具有相对创伤小、术后并发症少、住院时间短等优点，但其长期血管通畅率和生存率低于前者［2］。其实，两者很难明确判断孰优孰劣，关键在于严格把握适应证［3］。目前研究认为，循环中microRNAs可作为多种疾病早期诊断和预后评估的生物学标记物，血小板microRNAs是其重要组成部分，血小板激活后，血浆中其microRNAs会不同程度的升高［4］，其中miR－223和miR－126变化较大［5－6］。相对于off－pump，CPB对血液凝血系统影响更大，但对凝血功能具体影响，血小板功能、microRNAs与转机时间的关系，目前国内研究较少。本试验通过检测术中的血小板功能和血小板miR－223、miR－126水平，比较CPB和off－pump下血小板microRNAs和凝血功能变化，同时了解血小板microRNAs、血小板功能与转机时间的关系。

1 资料与方法

1．1 研究对象 选取2015年8月至9月50例CABG患者入组，分为CPB组（n＝25）和off－pump组（n＝25）。术前常规停用阿司匹林、硫酸氢氯吡格雷7天，低分子肝素抗凝。排除标准为急诊、二次手术、CABG合并其他手术、慢性肝肾和血液系统疾病。记录患者术前资料，包括性别、年龄、身高、体重、身体质量指数（BMI）、有无高血压病史、糖尿病病史、高脂血症病史、外周血管病史、脑血管病史；术前血清肌酐（Cr）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、术前左室射血分数（EF）；术中冠状动脉远端吻合口数、血液回收输入量；CPB参数：CPB时间、主动脉阻断时间、最低鼻温、最低肛温等。记录ICU住院时间、呼吸机使用时间。

1．2 研究方法 患者术前常规进行左桡动脉和右侧颈内静脉穿刺；常规麻醉诱导插管，诱导药物使用依托咪酯、芬太尼、维库溴铵。诱导后患者经口插入气管插管。术中采用静脉持续麻醉。

CPB采用滚轴泵和非涂层管路，应用常规预充液（6%羟已基淀粉130／0．4 1 000 ml、乳酸林格液600 ml、肝素4 000 U）。ACT＞480 s进行CPB，流量维持着2．2～2．4 L／（min·m2）。升主动脉阻断后，采用晶体和动脉血氧合（1∶4）灌注冠状动脉，SvO2维持在60%～75%。鼻咽温度降至30℃左右，血气管理采用α稳态，CPB期间MAP维持50～70 mm Hg。直肠温达36．0℃后可以停机。CPB结束后按照1∶1比例中和肝素（1 mg鱼精蛋白：100 U肝素）。术中常规应用血液回收系统收集术野失血，经离心清洗后回输。

1．3 观察项目 麻醉诱导后（T1）、鱼精蛋白中和5 min后（T2）两个时间点采集患者静脉血测定血常规。快速血栓弹力图仪（r－TEG，TEG 5000型，美国Haemoscope公司）测定参数包括：TEG－ACT值（反应时间，正常值86～118 mm）、K值（血凝块时间，正常值34～138 s）、α角（凝固角，正常值64～80°）和MA（血凝块强度最大振幅，主要反应血小板功能，正常值52～71 mm）。利用ABI 7900荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）实时荧光染料法定量检测miR－223和miR－126基因的表达：以线虫 miR－5652为外参，基因编码为 GGCCGGTTGAATGT⁃GAATGAA（5＇－3＇）；按照 miRcute miRNA（TIAN⁃GEN）试剂盒步骤提取血浆总RNA，逆转录目的基因，然后进行定量PCR扩增；反应条件为：95℃预变性3min后，94℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s；共进行40个循环。基因表达变化倍数采用2－ΔCt法进行比较，ΔCt＝Ct目的基因－Ctath－miR－5652。

1．4 统计学方法 统计分析应用SPSS 22．0软件，正态分布计量资料以均数正负标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；非正态分布计量资料以中位数（四分位数）表示，组间比较采用秩和检验；计数资料采用X2检验；手术前后资料两组比较采用重复测量数据方差分析。P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2．1 一般资料 患者术前一般临床资料两组间差异无统计学意义；两组患者术中冠脉血管远端吻合口数、呼吸机使用时间存在明显差异，见表1。CPB时的转机时间（94．2±17．5）min、主动脉阻断时间（66．1±13．8）min、最低鼻咽温（31．7±1．2）℃、最低肛温（32．3±1．3）℃。

2．2 血常规、r－TEG检测结果 血常规：血小板计数和血红蛋白浓度术前CPB组和off－pump组均无差异（P＝0．477，P＝0．089）；相比于T1，T2时间点两组血小板计数、血红蛋白均明显下降，且都具有统计学意义（P＜0．001，P＜0．001），且两组之间存在明显差异性（P＝0．030，P＜0．001）。r－TEG：①MA值：在off－pump组，T1和 T2的MA值未见统计学意义（P＝0．098）；CPB组，T2时MA值比术前明显减小（P＜0．001），但中位数均在正常范围内。两组未见明显统计学意义（P＝0．073）。②TEG－ACT：两组术前、术后（P＝0．285、P＝0．575）组别之间均无统计学差异（P＝0．563）。③K：在off－pump组，T1和T2的K值未见统计学意义（P＝0．662）；CPB组，T2时K值比术前明显延长（P＝0．002）。但两组之间未见差异性（P＝0．067）。④α角：在offpump组，T1和 T2的α角未见统计学意义（P＝0．118）；CPB组，T2时α角比术前明显减小（P＜0．001）。两组无差异性（P＝0．059）。见表2。

表1 围手术期两组患者一般临床资料

2．3 MicroRNAs检测结果 相对于T1，T2时miR－223和miR－126均明显增高（P＜0．001，P＜0．001），CPB组升高更明显（P＜0．001）。见表3。

2．4 MA、MicroRNAs与转机时间的关系 进一步分析发现，鱼精蛋白中和后MA与转机时间直线关系（r＝0．64，P＝0．008）。见图1。采用非参数回归的曲线拟合方法，局部多项式估计（Loess）发现，Mi⁃croRNAs与转机时间存在曲线变化，见图2和图3。

表2 血常规及r－TEG指标比较（n＝25）

表3 两组血小板MicroRNAs表达比较（n＝25，±s）

表3 两组血小板MicroRNAs表达比较（n＝25，±s）

注：∗∗为与T1比较，P＜0．01；＃＃为与转机组比较，P＜0．01。

项目 CPB组off－pump组T1 T2T1 T2 miR－126 0．35（0．19～0．61） 6．18（0．91～30．22）∗∗0．27（0．18～0．54） 1．08（0．41～2．19）∗∗＃＃miR－223 0．23（0．15～0．74） 4．90（2．14～9．20）∗∗0．22（0．13～0．50） 0．61（0．17～1．84）∗∗＃＃

图1 鱼精蛋白中和5 min后MA与转机时间的关系

图2 鱼精蛋白中和5min后2－ΔCtmiR－126与转机时间散点图及曲线拟合

图3 鱼精蛋白中和5 min后2－ΔCtmiR－223与转机时间散点图及曲线拟合

3 讨 论

CPB下CABG是传统心脏外科手术之一，近年来，off－pump下CABG手术（off pump coronary artery bypass，OPCAB）由于相对创伤小、痛苦小、恢复快等优点而受到外科医生的青睐。临床医生认为OP⁃CAB可明显减少CPB带来的多种并发症，所以会带来更大的获益，但越来越多的meta分析和随机对照实验表明，两者在死亡率、卒中、心肌梗死、术后认知方面未见明显差异性［2，7－8］；OPCAB的远期血管通畅率和长期存活率低于CPB下手术患者［2］，所以临床上谁获益更大两者仍存在争议。

本试验表明CABG鱼精蛋白中和后，两组血红蛋白、血小板计数均有不同程度的下降，且CPB组下降更明显。CPB结束后血细胞计数的上述变化，与既往研究类似［9］。首先，CPB存在一定的血液稀释；其次，CPB过程中，血液与大量的外源性异物表面接触发生反应是导致血液系统发生变化的主要原因，如泵的机械转动对泵管的挤压，心内吸引等多种因素产生涡流和剪切力变化，红细胞表面张力发生改变均可导致血细胞破坏［10］；同时血小板会吸附于管路及膜肺的表面产生聚集反应，甚至释放反应［11］。以上因素相互影响会引起血细胞计数的变化。

综合鱼精蛋白中和后血常规和TEG结果可见，相对于off－pump，CPB下心脏外科手术对血液系统影响相对较大，原因是多方面的，除了上述提到的血小板计数减少外，CPB时血液稀释、低温、炎症反应、补体激活等因素均对凝血系统产生不同程度的影响［11］。值得一提的是，停CPB后，两组血小板功能均有下降，但中位数均在正常范围内，且两组之间未见统计学意义。提示随着管路材料的发展，CPB管理的完善［12－13］，外科手术的成熟和提高，特别是对于转机时间相对较短的CABG术，与既往相比，CPB对机体凝血功能的影响有所减轻，其安全性逐渐提高［14］。进一步分析发现，鱼精蛋白中和后血小板功能随着转机时间的延长有升高的趋势。原因可能是，在转机开始时，活化的血小板黏附于暴露的内皮下组织及CPB管道系统，与循环中的单核细胞或中性粒细胞结合，血小板数量、功能较术前偏低，随着时间延长，部分与管壁结合的血小板脱落进入血液循环，同时CPB引起儿茶酚胺大量释放，通过与血小板表面的α－腺苷受体结合可使血小板对其他激活剂的反应能力大大增强，血小板功能代偿性增高［11］，但均仍低于术前水平。然而这并不意味着转机时间越长，血小板功能的代偿就越强［15］。

MicroRNAs是一类进化上保守的非编码RNA，它主要通过靶标基因3’UTR区的完全或者不完全互补配对，抑制靶标基因mRNA的转录、翻译或者能够剪切靶标基因mRNA并促进其降解，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。健康人血小板的microRNAs已发现将近500种［16］，研究认为，血小板激活后可释放大量血小板microR⁃NAs，含量丰富的包括miR－223、miR－24、miR－126、miR－191，可作为血小板激活的指标，反映血小板的活性［6］。本研究结果表明CABG术与术前相比，鱼精蛋白中和后血小板miR－223、miR－126均呈现显著升高，CPB组升高更明显。进一步曲线拟合发现，鱼精蛋白中和后miR－223、miR－126随着转机时间的延长呈现不同变化趋势，在90 min左右达高峰。由此可见，血小板的激活与血小板的功能变化并不完全同步。原因可能是，CPB管路与血液接触后，大量血小板被激活，其细胞内miR－223、miR－126逐渐释放入血液中，随着转机时间延长，血小板激活的数量持续增多，microRNAs表达呈升高趋势；但随着时间进一步延长，血小板的破坏不断增加，miR－223、miR－126持续降解，血液中microRNAs含量逐渐下降；另外，试验中血小板功能的检测仅反映流转时血液中的血小板，而无法测量贴壁吸附于管壁上的血小板的功能。

本研究存在一定的局限性：①样本量有限，且为单中心数据，在不同地区、医院，外科手术对血小板数量及功能影响不同，同时手术患者难以做到完全随机性分组；②CABG术转机时间相对较短，未能完全反映出停机后血小板功能和转机时间的关系。

综上，近年来随着医疗技术的不断发展，特别是对于转机时间相对较短的CABG术，CPB对患者的凝血功能的影响较前减小；CPB后几乎所有患者血小板功能均在正常范围内，与转机时间（＜140 min）成正比；而血小板miR－223、miR－126水平随转机时间呈双向变化。

4 结 论

CABG鱼精蛋白中和后 Hb、Plt均明显降低，CPB组下降的更明显。虽然CPB和off－pump术后血小板功能也有不同程度下降，但绝多数患者均在正常范围内。鱼精蛋白中和后血小板功能随着转机时间延长而代偿性增高，而血小板miR－223、miR－126水平在转流90 min左右达高峰，两者变化趋势并不完全同步。该结果仍需更多观察和研究去证实。

［1］ Lattouf OM，Adams KN．Current readings on off－pump coronary artery bypass［J］．Semin Thorac Cardiovasc Surg，2013，25（3）：228－236．

［2］ Møller CH，Penninga L，WetterslevJ，etal．Off－pump versusonpump coronary artery bypass grafting for ischaemic heart disease［J］．Cochrane Database Syst Rev，2012，CD007224．

［3］ Cooper EA，Edelman JJ，Wilson MK，et al．Off－pump coronary artery bypass grafting in elderly and high－risk patients－－a review［J］．Heart Lung Circ，2011，20（11）：694－703．

［4］ Willeit P，Zampetaki A，Dudek K，et al．CirculatingmicroRNAs as novel biomarkers for platelet activation［J］．Circ Res，2013，112（4）：595－600．

［5］ McManus DD，Freedman JE．MicroRNAs in platelet function and cardiovascular disease［J］．Nat Rev Cardiol，2015，12（12）：1－7．

［6］ 苗晓蕾，刘晋萍，崔勇丽，等．血小板microRNAs在先天性心脏病患儿中输血导致的血小板激活作用研究［J］．中国体外循环杂志，2015，13（1）：1－5．

［7］ Kennedy ED，Choy KC，Alston RP，et al．Cognitive outcome af⁃ter on－and off－pump coronary artery bypass grafting surgery：a systematic review and meta－analysis［J］．J Cardiothorac Vasc Anesth，2013，27（2）：253－265．

［8］ Alston RP．Brain damage and cardiopulmonary bypass：is there re⁃ally any association［J］？Perfusion，2011，26 Suppl 1：20－26．

［9］ Hornick P，George A．Blood contactactivation：pathophysiological effects and therapeutic approaches［J］．Perfusion，1996，11（1）：3－19．

［10］ Keyser A，Hilker MK，Diez C，et al．Prospective randomized clinical study of arterial pumps used for routine on pump coronary bypass grafting［J］．Artif Organs，2011，35（5）：534－542．

［11］ Thiele RH，Raphael J．A 2014 update on coagulationmanagement for cardiopulmonary Bypass［J］．Semin Cardiothorac Vasc Anesth，2014，18（2）：177－189．

［12］ Ng CS，Wan S．Limiting inflammatory response to cardiopulmonary bypass：pharmaceutical strategies［J］．Curr Opin Pharmacol，2012，2（2）：155－159．

［13］ Finley A，Greenberg C．Review article：heparin sensitivity and re⁃sistance：management during cardiopulmonary bypass［J］．Anesth Analg，2013，116（6）：1210－1222．

［14］ Esper SA，Subramaniam K，Tanaka KA．Pathophysiology of Car⁃diopulmonary Bypass：Current Strategies for the Prevention and Treatment of Anemia，Coagulopathy，and Organ Dysfunction［J］．Semin Cardiothorac Vasc Anesth，2014，18（2）：161－176．

［15］ 龙村，黑飞龙，朱德明等．体外循环教程［M］．北京：人民卫生出版社，2011．199－422．

［16］ PléH，Landry P，Benham A，etal．The repertoire and featuresof human platelet microRNAs［J］．PLoS One，2012，7（12）：e50746．

Study of plateletm icroRNA activation and p latelet function in adult patients un⁃dergoing coronary artery bypass grafting

Chen Liang，Lyu Lin，Long Cun，Lou Song
Department of Extracorporeal Circulation，Fuwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100037，China

Objective To evaluatethe change of plateletmicroRNA levels and the platelet functionin patients after off－pump versus on－pump coronary artery bypass graft（CABG）surgery and to observe the relationship between the function of platelet and car⁃diopulmonary bypass（CPB）time．M ethods Consecutive adult patientswere assigned to on－pump or off－pump CABG surgery from August2015 to September 2015．Exclusion criteria included emergency operation，re－operation，compound operation and the chronic disease of liver，renal and blood system．Preoperative demographic data was recorded．The function of platelet（MA）and coagulation were tested by thrombelastogram（TEG）at two intervals，namely after anesthesia induction（T1）and 5mins after protamine neutraliza⁃tion（T2）．The expression levels ofmiR－223 and miR－126 were detected by real－time PCR．Results Fifty patientswere entered into this study（25 patients off－pump and 25 on－pump CABG surgery）．Compare with T1，the hemoglobin（Hb），platelet count（PLT）and MA levels in both groups significantly decreased after heparin reversal．The platelet function ofmost patientswere at normal range．There was significant difference between the two groups in the reduction of the Hb and PLT exceptMA．The level of bothmicroRNAs in two groups significantlyincreased at T2（P＜0．001）．There was a liner correlation between MA and CPB（r＝0．64，P＝0．008）．Con⁃clusion The levels of HB，PLT and MA in two groups significantly decreased after heparin reversal．The effect of on－pump CABG surgery on platelet function was similar to that of the off－pump surgery．The function of platelet after protamine administeration in⁃creased with CPB time，the pattern ofwhich was different from the trend of plateletmicroRNAs activation．

Coronary artery bypass grafting；Cardiopulmonary bypass；MicroRNAs；Platelet function

2016⁃01⁃06）

2016⁃04⁃18）

10．13498／j．cnki．chin．j．ecc．年．期．流水号

100037北京，中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院体外循环科［陈良（研究生）］

楼松，lousongfw＠163．com