BCR-ABL融合基因在慢性粒细胞白血病临床诊治中的研究进展

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(1.深圳市盐田区人民医院科教科，广东 深圳 518081；2.深圳大学医学院部)

·文献综述·

BCR-ABL融合基因在慢性粒细胞白血病临床诊治中的研究进展

蒋明1，陈文聪2，郑多2

(1.深圳市盐田区人民医院科教科，广东 深圳 518081；2.深圳大学医学院部)

BCR-ABL融合基因是慢性粒细胞白血病(CML)的特征性标志，根据BCR的断裂位置主要分为3个类型：M-BCR、m-BCR及μ-BCR。采用分子生物学技术检测BCR-ABL融合基因的表达、突变对于CML的临床诊断、治疗以及预后都具有非常重要的意义。

慢性粒细胞白血病； BCR-ABL融合基因； 分子生物学技术

慢性粒细胞白血病CML(chronic myeloid leukemia，CML)是由于造血干细胞的恶性克隆而引起的疾病，在白血病病例中占15%～20%[1-2]。CML的主要特征是在外周血、脾以及骨髓中的未成熟或者成熟的髓细胞增多，并且细胞中带有异常的染色体Ph(Philadelphia Chromosome)。Ph染色体是由位于第9号染色体长臂远端的白血病原癌基因ABL易位至第22号染色体BCR基因的断裂点形成的[3-5]，在分子水平上产生了BCR-ABL融合基因，导致持续且异常活化的酪氨酸激酶，干扰细胞的正常增殖和凋亡程序，导致白血病的发生[6-7]。

以往临床使用细胞遗传学的方法以及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术检测Ph染色体用于诊断CML的金标准，并进行疗效的监测。随着对BCR-ABL融合基因的不断研究，对酪氨酸激酶的功能了解越来越深入。目前对CML患者的治疗，已从传统的姑息性治疗、化疗，发展到使用特异的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)进行分子靶向治疗[8]。经过TKI治疗后，可以达到完全的细胞遗传学的缓解(complete cytogenetic remission，CCR)，即Ph阳性的细胞消失，患者体内可能只存在微小残留病灶[9]，但是以往的细胞遗传学等技术存在弊端，无法对白血病患者的微小残留病变(minimal residual disease，MRD)进行检测[10-11]。因此对CML的诊断、监测等就有了更高灵敏度、准确度的要求。此外，在致病和病情演变过程中，BCR-ABL融合基因会出现多样性以及多变性。随着TKI临床应用的增加，分子靶向治疗的耐药问题开始出现，导致药物治疗无法达到预定的效果，给疾病的治疗带来了新的阻碍[12-13]。应用分子生物学的技术手段，对BCR-ABL融合基因及其突变进行全面检测，对于CML的诊断、治疗以及预后都具有重要的意义。

1 BCR-ABL融合基因

BCR-ABL融合基因根据BCR的断裂位置，主要分为3个类型：M-BCR、m-BCR及μ-BCR(图1)[14]。M-BCR区，是位于外显子b1～b5之间5.8 kb的区域，转录成b2a2(e13a2)或b3a2(e14a2)型的mRNA，编码p210蛋白；m-BCR区，是位于外显子e2′和e2之间的54.4kb的区域，转录成e1a2型的mRNA，编码p190蛋白；μ-BCR区，位于外显子19下游，转录成e19a2型的mRNA，编码p230蛋白[15-17]。

在BCR-ABL融合基因中，主要是由ABL段携带细胞恶变的主要信息，而BCR段的断裂位点主要影响疾病的表型。p210蛋白可见于90%以上的CML患者以及1/3的Ph阳性的成人前体B细胞急性淋巴细胞白血病(precursor B-acute lymphoblastic leukemia，BALL)患者；p190蛋白可见于2/3的BALL患者、3%的非典型CML和慢性粒细胞单核细胞白血病(chronic myelo-monocytic leukemia，CMML)患者；而p230蛋白主要见于Ph阳性的慢性中性粒细胞白血病(chronic neutrophilic leukemia，CNL)患者[18]。

图1 BCR和ABL基因以及它们主要转录产物的分子结构 箭头表示BCR和ABL基因的断点

因此，对BCR-ABL融合基因的分型检测有助于了解疾病的表型。

2 BCR-ABL融合基因在CML诊断的作用

Ph染色体是临床诊断CML的重要依据。传统的细胞遗传学的技术，需要制备骨髓染色体标本，再利用R显带的技术进行染色体核型的分析。其检测结果直观，灵敏度可以达到5%[19]。传统的细胞遗传学方法优势在于可检测到其他的染色体异常，但无法对白血病患者的MRD进行检测。此外，细胞遗传学检测的另一个限制在于，需要进行骨髓穿刺活检来获得可培养的中期细胞，耗时长，技术要求也较高。利用BCR和ABL的DNA探针的荧光原位杂交(FISH)的方法也常用来进行CML的监测。但FISH实验操作较复杂，若标本处理不当则难以检出，因而作为临床常规的监测CML的手段也并不适合。

近年来随着分子生物学的快速发展，应用分子生物学方法检测BCR-ABL融合基因在逐渐普及[20-21]。使用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，不仅可以检测BCR-ABL融合基因，确定融合基因的确切断裂位点，而且对MRD的检测也具有高度的敏感性。因此PCR被作为临床诊断、监测CML的重要手段。PCR技术经过多年的发展，对BCR-ABL融合基因的mRNA检测在不断改进，已经从定性发展到定量检测，从反转录后再进行扩增发展到一步法反转录实时荧光定量法，使得检测结果更加的可靠、直观，而且便于分析。在荧光定量的检测中，采用TaqMan MGB探针的方法，可以避免传统的TaqMan探针产生的本底荧光对检测结果的影响，且快速、高灵敏，无需PCR后处理，因此被广泛地应用于临床检测。尤其是引入内参基因，可以降低仪器、试剂、工作人员的操作以及样本中细胞数量差异等因素对定量结果的影响，在MRD监测中发挥重要作用，也为临床治疗提供了可靠的依据。

目前采用RQ-PCR的方法来检测BCR-ABL融合基因，已经成为检测患者是否还残留有MRD或是否已经治愈的重要手段[22]。在对患者进行BCR-ABL融合基因的RNA检测时，样本可以采用外周血，或者进行骨髓抽样[23]。在BCR-ABL融合基因水平较低时，两种样本中的BCR-ABL定量检测的结果差异很小，但在CML急变期，有时骨髓标本中的BCR-ABL融合基因水平显著高于外周血。但考虑到外周血标本能够明显地反映临床治疗的疗效，并且标本也容易采集，在慢性期，可常规采用外周血来进行定期监测。目前普遍认可的标准是，对患者进行临床诊断或经过治疗达到完全的细胞遗传学的缓解后，会每三个月进行一次监测性的检测，从而可以对患者的临床病情变化提出警示。定期检测对于肿瘤微小残留病灶的监测和治疗方案的及时调整都有重要意义[24]。

因此，采用RQ-PCR的方法来检测BCR-ABL融合基因快速、灵敏高，是临床诊断CML、监测CML微小病灶的重要手段之一。

3 BCR-ABL融合基因与CML治疗及预后的关系

BCR-ABL融合基因引起了持续活化的酪氨酸激酶，使用特异的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)进行分子靶向治疗，极大地改善了CML疾病的预后[2,25]。BCR-ABL的表达水平与临床疗效之间有着很好的相关性。RQ-PCR方法可以在TKI治疗的前三个月便检测出病变的明显变化，可以以此作为病患后期治疗的依据。通常认为，在达到完全的细胞遗传学缓解时，BCR-ABL定量检测的结果应较治疗前下降3个对数值以上。

甲磺酸伊马替尼(别名：格列卫，imatinib)，是第一个分子靶向药物，它是ATP的模拟物，较ATP有更强的亲和力，通过竞争性与BCR-ABL酪氨酸激酶ATP结合位点结合，阻止ATP的结合与水解，从而阻断BCR-ABL磷酸化，使其失活，进而阻断其活化的信号传导通路[9,26]。甲磺酸伊马替尼并不能根治CML，它是通过抑制BCR-ABL融合蛋白的激酶活性来发挥作用的，本身并不能抑制融合蛋白形成，因此在停药后疾病易复发。部分病人可对甲磺酸伊马替尼产生耐药性，主要表现为治疗无效(原发或内源性耐药)，或缓解后的复发(继发性耐药)。

第二代酪氨酸激酶抑制剂，如达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)等，能够克服甲磺酸伊马替尼耐药的大部分突变[27-29]。当然第二代酪氨酸激酶抑制剂的使用也要根据患者的实际情况，当患者带有Y253H、E255K/V或者F359C/V突变时最好使用达沙替尼，而带有V299L和F317L突变时，则最好使用尼洛替尼[30]。

而当患者产生甲磺酸伊马替尼耐药，而又不具有达沙替尼、尼洛替尼的相应适用突变时，可以考虑使用第三代酪氨酸激酶抑制剂如伯舒替尼(bosutinib)[31-32]。当患者产生T315I突变的情况下，应考虑使用帕纳替尼(Ponatinib)[33]。帕纳替尼也是第三代酪氨酸激酶抑制剂，而T315I突变患者对于目前已有的其他酪氨酸激酶抑制剂均耐药。

患者对酪氨酸激酶抑制剂抵抗的机制主要有以下几个方面：1)BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶区发生突变，使药物结合位点的酪氨酸激酶结构域的空间构象发生改变，导致药物不能竞争性地结合BCR-ABL；2)由于BCR-ABL扩增或过度的表达，超过了药物的竞争结合能力；3)其他基因异常导致耐药，因而CML克隆的增生不完全依赖BCR-ABL，如多药耐药蛋白(multi-drug resistance protein，MRP-1)的表达等[34-36]。患者耐药可能由上述一种或多种的机制协同导致，但研究表明，约80%的耐药是由于融合蛋白ABL激酶区的突变引起的。ABL激酶区突变主要集中于ATP的结合区(P环，第244～255氨基酸)、T315、M351及活化区(A环)四个区域，不同的突变位点引起的耐药程度不同[37]。

对于BCR-ABL融合基因突变的检测，目前多采用测序的方法进行。测序方法可以检测各种可能出现的突变类型，但其检测的灵敏度只有20%～25%。用位点特异性PCR的方法进行突变检测，检测灵敏度可达1‰～1%，但只能检测出特定位点的突变[38]。因为每个不同的突变都有可能与特别的临床预后情况相关，因此，如果能够全面精密地检测出突变位点，甚至突变所占的比例，可以给临床医生选择疾病的治疗方案带来极大地便利[39]。

因此，BCR-ABL融合基因检测可以监测CML治疗的疗效，检测BCR-ABL融合基因突变可以监测酪氨酸激酶抑制剂治疗后耐药情况的发生。

4 小 结

目前CML分子靶向治疗的方案，对临床BCR-ABL融合基因的检测方法提出了更高的要求。RQ-PCR方法具有高灵敏性，而且快速准确的特点，显示出优于传统细胞遗传学和FISH方法的优势，使其成为临床诊断及监测CML的发展趋势。同时，检测耐药相关的BCR-ABL融合基因ABL激酶区的突变，也是临床治疗中必不可少的一部分。在临床诊疗中，不仅要考虑到不同的BCR-ABL融合基因的类型和疾病的表型之间的关系，还要注意选择合适的定量监测时间点，同时也需要进行耐药突变等情况的监测。只有根据每位患者的病情以及疾病的发展，来应用适当的检测策略，才能真正做到精确的个体化治疗，获得更快的疗效和更好的预后。

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深圳市盐田区科技计划资助项目(201301).

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蒋湘莲)