Apelin-13通过AMPK通路抑制同型半胱氨酸诱导的内皮细胞损伤

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(1.南华大学附属第二医院心血管内科 湖南衡阳 421001；2.解放军第一六九医院普外科；3.南华大学附属第二医院泌尿外科；4.衡阳市中心医院急诊科)

·基础医学·

Apelin-13通过AMPK通路抑制同型半胱氨酸诱导的内皮细胞损伤

王波1,周洁2,张涛3,李国术4,曾高峰1*

(1.南华大学附属第二医院心血管内科 湖南衡阳 421001；2.解放军第一六九医院普外科；3.南华大学附属第二医院泌尿外科；4.衡阳市中心医院急诊科)

目的观察Apelin-13对同型半胱氨酸(Hcy)诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用并探讨其可能的作用机制。方法采用10 mmol/L Hcy处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)24 h，诱导内皮细胞的损伤。采用不同浓度(0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L)的Apelin-13预处理1 h，再加入含Hcy的培养基中继续孵育24 h，观察细胞的损伤情况。采用MTT法测定细胞活力，比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性。采用Western Blot检测HUVECs中磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)蛋白表达。结果与对照组比较，Hcy组细胞的存活率显著降低，细胞培养液中LDH活力显著性升高(均P<0.05)。与Hcy组组比较，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)预处理组细胞的存活率均显著升高，细胞培养液中LDH活力显著性降低(均P<0.05)。Hcy组HUVECs细胞中p-AMPK蛋白的表达与对照组比较没有显著性差异(均P>0.05)。与Hcy组比较，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)预处理组HUVECs细胞中p-AMPK蛋白的表达显著性下调(均P<0.05)。AMPK抑制剂Compound C部分取消了Apelin-13的内皮细胞保护作用。结论Apelin-13抑制了同型半胱氨酸诱导的内皮细胞损伤，其机制与可能与上调AMPK的磷酸化有关。

Apelin-13； 腺苷酸活化蛋白激酶； 同型半胱氨酸； 内皮细胞

心脑血管疾病是导致人类死亡的三大疾病之一，目前在我国心血管疾病患者高达 2.3亿，严重威胁着人们的身心健康。动脉粥样硬化(arteriosclerosis,AS)是心脑血管疾病重要的病理生理学基础，近年来的研究显示高同型半胱氨酸血症(homocysteine,Hcy)是AS独立的危险因素[1]。血管内皮细胞的损伤是AS重要的始动环节，Hcy可导致血管内皮细胞的损伤，从而导致AS的发生[2]。因此保护血管内皮细胞是防治心脑血管疾病的重要途径。 Apelin是1998年由Tatemoto等从牛胃的分泌物中分离提取出的G蛋白耦联受体血管紧张素受体ATl相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor ATl,APJ)的内源性配体[3]。Apelin/APJ在心血管系统有大量的分布，Apelin具有扩张血管、降低系统血压、促进血管内皮细胞有丝分裂、对内皮细胞功能的维护发挥重要的作用[4]。但是Apelin对Hcy诱导的内皮细胞损伤是否具有保护作用以及作用机制尚不清楚。因此本研究拟观察Apelin对Hcy所致的内皮细胞损伤的抑制作用，并从AMPK通路的角度探讨其内皮保护作用的可能机制，为以AS为基础的心脑血管疾病的防治提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1材料杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium,DMEM)和胎牛血清为Introgen公司产品；青霉素、链霉素和噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT) 为Sigma公司产品。Apelin-13多肽为美国Phoenix Biotech公司产品。AMPK抑制剂Compound C为美国Sigma公式产品。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为南京建成生物工程公司产品。兔抗人腺苷酸活化蛋白激酶(Amp activated protein kinase,AMPK)和β-actin的单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均为美国Santa Cruz公司产品。CO2细胞培养箱(美国Krownus公司)、多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。垂直电泳仪与转膜系统(美国BioRad公司)和凝胶成像分析系统(美国UVP公司)和图像分析系统(武汉华海公司)。

1.2细胞培养和分组人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)株由中南大学湘雅医学院细胞中心提供。HUVECs解冻复苏后，用含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基常规培养，细胞置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育，隔天传代，处于对数生长期的融合生长至80%左右的细胞用于实验。实验共分为以下各组：对照组(细胞在普通培养基中培养24 h)、Hcy组(细胞在含10 mmol/L Hcy 的培养基中孵育24 h[5])、Apelin-13预处理组(先分别加入0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L的Apelin-13预处理1 h[6]，再加入含Hcy 的培养基中继续孵育24 h)及AMPK抑制剂Compound C组(先加入15 μmol/L Compound C预处理细胞0.5h，再加入10.0 μmol/L Apelin-13处理细胞1 h，再加入含Hcy 的培养基中继续孵育24 h)。

1.3 MTT法检测细胞活力用胰酶消化后将 HUVECs细胞制成细胞悬液，计数细胞的密度，以1×104个细胞/孔接种到96孔培养板内。实验结束后每孔加入100 μL MTT，确保MTT的终浓度为0.5 mg /mL，继续培养4 h，吸去培养液。每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，使结晶完全溶解。在酶标仪上测定570 nm波长的吸光度值(OD值)，每组设重复孔3个。计算各组细胞的存活率，以对照组为参照(细胞存活率为100%)，计算其它各组细胞存活率=[处理组OD值/对照组OD值]×100%。

1.4 LDH活力的检测乳酸脱氢酶(LDH)可将乳酸催化生成为丙酮酸，而产生的丙酮酸可与2，4-硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，丙酮酸二硝基苯腙在碱性环境中呈现出棕红色，丙酮酸二硝基苯腙的水平与LDH的活力呈正相关，因此通过比色法可测量出LDH的活力。各组实验结束后，分别收集每组细胞培养液的上清液，测量各组细胞上清液中LDH活性，操作按LDH试剂盒说明书的要求进行。用酶标仪测定波长为450 nm的吸光度，每组设3个重复孔。

1.5 Western Blot分析按试剂盒说明进行操作提取各组HUVECs细胞的总蛋白，BAC法测定蛋白浓度。取100 μL蛋白样本加入到2×SDS凝胶加样缓冲液中煮沸充分变性蛋白。进行SDS-PAGE 电泳1 h分离蛋白，分离的蛋白通过半干法转膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(Phosphorylation amp activated protein kinase,p-AMPK)(1∶200)和总的腺苷酸活化蛋白激酶(total amp activated protein kinase,t-AMPK)(1∶400)的一抗，4 ℃下过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶300)，室温孵育6 h。洗膜后，蛋白印迹荧光检测试剂盒显示于X线片，经显影、定影后，Labworks图像分析系统对结果进行灰度扫描，采用目的基因与内参灰度值的比值进行半定量分析。

1.6统计学分析计量资料以用表示，多组间差异分析比较采用单因素方差分析；组间差异的两两比较采用LSD-t检验。采用SPSS 18.0统计软件处理实验数据，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hcy和Apelin-13对HUVECs细胞存活率的影响采用MTT法检测HUVECs细胞活力，结果如图1所示：与对照组比较，Hcy组细胞的存活率显著降低(P<0.05)；与Hcy组组比较，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)预处理组细胞的存活率均显著升高(均P<0.05)；而Apelin-13(0.1 μmol/L)预处理组与Hcy组比较细胞的存活率没有显著性差异(P>0.05)。

图1 Hcy和Apelin-13对HUVECs细胞存活率的影响 与对照组比较，a:P<0.05；与Hcy组比较，b:P<0.05

2.2 Hcy和Apelin-13对HUVECs细胞培养液中LDH活力的影响结果如图2所示：与对照组比较，Hcy组细胞培养液中LDH活力显著性升高(P<0.05)。与Hcy组比较，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)预处理组细胞培养液中LDH活力显著性降低(均P<0.05)。而Apelin-13(0.1 μmol/L)预处理组与Hcy组比较细胞培养液中LDH活力没有显著性差异(P>0.05)。

图2 Hcy和Apelin-13对HUVECs细胞培养液中LDH活力的影响 与对照组比较，a:P<0.05；与Hcy组比较，b:P<0.05

2.3 Hcy和Apelin-13对HUVECs细胞中AMPK磷酸化程度的影响结果如图3所示：对照组、Hcy组和Apelin-13(0.1、1.0和10.0 μmol/L)预处理组HUVECs细胞中t-AMPK蛋白的表达在各组间没有显著性差异(均P>0.05)。Hcy组HUVECs细胞中p-AMPK蛋白的表达与对照组比较没有显著性差异(均P>0.05)。与Hcy组比较，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)预处理组HUVECs细胞中p-AMPK蛋白的表达显著性上调(均P<0.05)，而Apelin-13(0.1 μmol/L)预处理组HUVECs细胞中p-AMPK蛋白的表达与Hcy组比较没有显著性差异(均P>0.05)。

2.4 AMPK抑制剂Compound C对Apelin-13作用的影响结果如图4所示：与Apelin-13(10.0 μmol/L)预处理组比较，AMPK抑制剂Compound C组细胞的存活率显著降低(P<0.05)，而细胞培养液中LDH活力显著性增加(P<0.05)，这些表明AMPK抑制剂Compound C部分取消了Apelin-13抑制Hcy诱导的HUVECs存活率的降低和细胞培养液中LDH活力水平增加的作用。

3 讨 论

血管内皮细胞构成了血液的屏障，具有调节血管张力，调节凝血和纤溶的平衡，参与炎症和免疫反应的调节等，在维持血管稳态中发挥着重要的作用。

图4 AMPK抑制剂Compound c对Apelin-13作用的影响与对照组比较，a:P<0.05；与Hcy组比较，b:P<0.05；与Apelin-13组比较，c:P<0.05

高Hcy血症是AS的独立危险因子之一，血管内皮细胞是Hcy的重要靶细胞之一[7]，因此，血管内皮的损伤和功能障碍是AS的始动环节，保护血管内皮细胞是防治以AS为基础的心脑血管疾病的重要举措。

Apelin是一种小分子的内源性多肽，其基因定位于人染色体的Xq 25-26.3，包含有2个内含子和3个外显子。Apelin前蛋白原包含有77个氨基酸，其羧基末端含有与APJ特异性结合的区域[8]。Apelin的羧基末端富含碱性氨基酸残基(主要包括精氨酸和赖氨酸)，是蛋白水解酶的酶切位点。蛋白水解酶可将Apelin前体肽水解为长度不同的多肽片段，包括Apelin-12、Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36等，其中Apelin/APJ系统在心血管系统的表达水平较高，与心血管系统关系密切，以Apelin-13尤为明显[9]。Apelin在心血管系统中有着广泛而重要的生理作用，对血管细胞具有保护作用。研究显示Apelin能够显著地降低高血压大鼠的动脉压，具有扩血管的作用[10]。Apelin-13还可逆转醛固酮对血管内皮细胞损伤及对血管紧张素Ⅱ诱导的肺微血管内皮细胞的损伤具有保护作用[11-12]。

本研究的研究结果显示1.0和10.0 μmol/L的Apelin-13预处理显著抑制了Hcy诱导的HUVECs存活率的降低和细胞培养液中LDH活力水平的增加，这些结果表明Apelin-13能抑制Hcy诱导的内皮细胞损伤。

Hcy损伤内皮细胞的机制目前还没有完全阐明清楚，近年来的研究发现激活 AMPK通路介导了Hcy对内皮细胞的损伤[13-14]。AMPK是一种异源三聚体蛋白，在真核细胞广泛存在，是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，AMPK由一个α催化亚基及β和γ两个调节亚基组成。AMPK能够调控细胞的能量代谢，AMPK作为感受细胞能量的开关在细胞的代谢调控中起到十分重要的作用。它的磷酸化激活可以对细胞能量代谢过程的一些关键蛋白激酶如：mTOR、PI3K及SREBP-1等进行调控[15]。AMPK也是参与自噬和细胞存活及调亡调控的重要分子，在细胞内AMPK被激活后可对P53、mTOR等在细胞存活、调亡和自噬中的关键调控分子进行磷酸化，进而对细胞的存活、调亡和自噬进行调控。研究表明Apelin对AMPK通路具有调控作用，Apelin-13可通过上调AMPK的磷酸化水平可促进进心肌微血管内皮细胞血管生成[16-17]。本研究的研究结果显示Apelin-13没有影响HUVECs细胞中t-AMPK蛋白的表达，却显著上调了Hcy处理的HUVECs细胞中p-AMPK蛋白的表达。而AMPK抑制剂Compound C部分取消了Apelin-13抑制Hcy诱导的HUVECs存活率的降低和细胞培养液中LDH活力水平增加的作用。因此这些结果表明Apelin-13可能通过上调AMPK磷酸化的水平，激活AMPK信号通过而发挥血管内皮的保护作用。

总之，我们的结果阐明Apelin-13抑制了同型半胱氨酸诱导的内皮细胞损伤，其机制与可能与上调AMPK的磷酸化有关，为以AS为基础的心脑血管疾病的防治提供理论依据和实验基础。

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Apelin-13InhibitstheDamageofEndothelialCellsInducedbyHomocysteineviaAMPKPathway

Wang Bo,ZHOU Jie,ZHANG Tao,et al

(DepartmentofInternalCardiology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China)

ObjectiveTo observate the protective effect of Apelin-13 on homocysteine (Hcy)-induced damage of vascular endothelial cells and to explore the possible mechanism.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were incubated with 10 mmol/L Hcy to induce damage.After pretreatment with Apelin-13 (0.1,1.0 and 10.0 μmol/L) for 1 h,the protective effect of Apelin-13 was investigated.MTT assay was used to detect the survival rate of cells.The level of lactate dehydrogenase (LDH) in the medium was measured by colorimetry.The expression of Amp activated protein kinase (AMPK) in HUVECs was measured by Western Blot.ResultsCompared with the control group,the survival rate of cells was singificantly decreased,the level of LDH in the medium was singificantly increased in the Hcy group (allP<0.05).Compared with the Hcy group,the survival rate of cells was singificantly increased,the level of LDH in the medium was singificantly decreased in the Apelin-13 (1.0 and 10.0 μmol /L) groups (allP<0.05).Compared with the control group,the expressions of p-AMPK in the Hcy group did not have singificant difference (P>0.05).Compared with the Hcy group,the expressions of p-AMPK in Apelin-13 (1.0 and 10.0 μmol /L) groups were singificantly up-regulated (allP<0.05).The endothelial cell protection of Apelin-13 was partly abolished by the inhibitor of AMPK Compound C.ConclusionApelin-13 inhibits the damage induced by homocysteine in HUVECs,which the mechanisms may be related to the up-regulation of AMPK phosphorylation.

Apelin-13; Amp activated protein kinase; homocysteine; endothelial cells

R543

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.007

2015-09-23；

2015-12-15

衡阳市科技计划项目(2011KJ49).

*通讯作者，E-mail：qichingnudou@tom.com.

秦旭平)