育龄女性MTHFR基因多态性与HCY关系的研究

杨丰美，于艳，张丽萍

(1.湖北医药学院附属太和医院妇产科, 湖北 十堰 442000; 2.泰州市姜堰区太宇医院检验科，江苏 泰州 225500)



育龄女性MTHFR基因多态性与HCY关系的研究

杨丰美1，于艳2，张丽萍1

(1.湖北医药学院附属太和医院妇产科, 湖北 十堰 442000; 2.泰州市姜堰区太宇医院检验科，江苏 泰州 225500)

目的：通过对育龄女性叶酸代谢关键酶5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFRC677T的基因多态性检测，分析MTHFRC677T基因多态性与外周血中同型半胱氨酸HCY的关系。方法：选取孕前或孕期育龄女性100名，基因芯片法检测外周血中MTHFRC677T的基因多态性，并对所有育龄女性口服800μg叶酸1个月，循环酶法检测口服叶酸前后不同基因型女性外周血中HCY水平。结果：本地区育龄妇女中MTHFRC677T基因CC型、CT型、TT型的检出频率分别为26%、54%、20%；口服叶酸前CC型、CT型、TT型受试者HCY水平分别为9.5±3.4、11.8±3.1、15.3±3.5，口服叶酸后CC型、CT型、TT型受试者HCY浓度较口服前低，分别为8.1±2.8、8.4±2.7、11.0±3.3，CC型受试者口服叶酸前后平均HCY水平之间差异无统计学意义(P>0.05)，CT型和TT型受试者口服叶酸前后平均HCY水平之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论：口服叶酸可以改善由于MTHFRC677T基因突变引起的高HCY血症，合理补充叶酸可以避免由于高HCY血症引起的出生缺陷。

亚甲基四氢叶酸还原酶；同型半胱氨酸；叶酸；多态性

出生缺陷在我国比较常见，总发生率大约5.6%[1]，出生缺陷的围生儿给社会和家庭带来了严重的负担。育龄女性体内的叶酸不能被机体有效利用或者摄入不足均可以导致婴幼儿出生缺陷的发生。叶酸的吸收或代谢障碍可以导致多种出生缺陷性疾病的发生，比如神经管畸形、先天性心脏病以及唇腭裂等[2-6]。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶，在HCY向蛋氨酸转化以及DNA合成过程中发挥着重要作用。虽然育龄女性口服叶酸在预防神经管畸形有着一定的作用，但是流行病学研究表明围孕期增补叶酸存在有地域性、人群性的差异[7-8]。本文采用基因芯片法检测MTHFR C677T等位基因的突变，分析基因突变与口服叶酸前后HCY浓度变化之间的关系，进而为降低高HCY血症引起的出生缺陷提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集我院2014年5月至2015年4月门诊接待的育龄女性100名，告知基因检测的目的和意义，根据知情同意后进行抽血及口服叶酸治疗。抽取外周EDTA-K2抗凝血3 mL用于全基因组DNA的提取。育龄女性平均年龄为(26.5±4.9)岁。

1.2 主要试剂与仪器

全血DNA提取试剂盒(北京天根)；ND-2000微量核酸定量仪(Thermo公司)；PE7500扩增仪(ABI)；AU2700全自动生化仪(贝克曼)；基因芯片仪，芯片识读仪(上海百傲)； HCY浓度检测试剂盒(北京九强)。

1.3 方法

1.3.1 口服叶酸 根据基因检测结果分为CC组、CT组和TT组。所有育龄女性给予800 μg剂量叶酸口服1个月。抽取口服叶酸前及口服叶酸1个月以后空腹外周EDTA-K2抗凝血5 mL用于检测叶酸以及HCY浓度。

1.3.2 HCY浓度检测 HCY在全自动生化分析仪上进行检测，所有试剂均采用配套试剂盒，定标后测试，正常参考区间按照说明书进行设置。

1.3.3 外周血中DNA提取 EDTA抗凝血采集后需按照试剂盒操作说明提取外周血中的全基因组DNA，若不能及时提取应4 ℃保存，一般不宜存放超过1周。提取后的DNA经微量核酸定量仪测定其浓度和纯度后进行PCR扩增或者-80 ℃保存备用。

1.3.4 PCR扩增 提取后的DNA经过PCR扩增获取PCR产物。扩增条件为：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35个循环；72 ℃ 5 min。获取的扩增产物需进行杂交反应或-20 ℃保存备用。

1.3.5 杂交及芯片识读 对上述PCR产物进行杂交，杂交体系及杂交条件参照说明书进行。杂交结束后将芯片放置于芯片识读仪中对结果进行扫描判定。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 所有育龄女性MTHFR C677T基因多态性分析

100名育龄女性中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的检出频率分别为26%、54%、20%，等位基因频率为C53%、T47%。育龄女性不同基因型(CC型、CT型、TT型)的判读结果如图1所示。

2.2 不同基因型育龄女性口服叶酸前后HCY浓度的变化

统计学分析发现，CC型受试者口服叶酸前后平均HCY水平之间差异无统计学意义(P>0.05)，CT型和TT型受试者口服叶酸前后平均HCY水平之间差异有统计学意义(P<0.05)。不同基因型育龄女性口服叶酸前后HCY浓度的变化如表1所示。

表1 不同基因型育龄妇女口服叶酸前后HCY浓度的变化

CC型口服前口服后CT型口服前口服后TT型口服前口服后HCY(μmol/L)9．5±3．48．1±2．811．8±3．18．4±2．715．3±3．511．0±3．3t值1．66．24．6P值>0．05<0．001<0．001

3 讨论

婴幼儿的出生缺陷是世界性关注的问题，特别是在发展中国家。叶酸的摄入和代谢障碍是导致出生缺陷的重要原因之一。叶酸是一种水溶性的B族维生素，吸收的叶酸以N5-甲基四氢叶酸的形式存在血液中，和白蛋白疏松结合运输，通过叶酸受体被摄入细胞内，在维生素B12依赖的蛋氨酸合成酶作用下形成四氢叶酸而发挥作用。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶，在叶酸代谢过程中起到重要作用。研究表明MTHFR 677位点的基因多态性可以影响到该酶的活性，叶酸浓度降低，蛋氨酸合成减少，进而使得HCY淤积过多，产生高HCY血症，导致神经管畸形的发生[9-12]。本文采用基因芯片法检测MTHFR C677T等位基因的突变，分析基因突变与口服叶酸前后HCY浓度变化之间的关系，进而为降低高HCY血症引起的出生缺陷提供一定的理论依据。

微阵列技术就是利用分子杂交原理，使同时被比较的标本(用同位素或荧光素标记)与微阵列杂交，并包被于芯片上，通过检测包被芯片杂交信号强度及数据处理，用一种直观图像反映出基因多态性的分型，常常用于遗传性基因多态性的分析。本文采用DNA微阵列芯片法检测育龄女性外周血中MTHFR基因多态性发现，MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的检出频率分别为26%、54%、20%，可以很好的检出MTHFR C677T基因多态性分型。研究表明CT型、TT型的基因突变可以降低MTHFR的酶活性，导致叶酸代谢途径障碍[13-14]。这就使得突变型的育龄女性在摄入正常剂量的叶酸时，由于MTHFR酶活性的降低导致高HCY血症，进而增加神经管缺陷的风险。而如果通过基因检测，使得突变型的育龄女性摄入大剂量的叶酸，提高酶活性，同样可以维持正常的HCY代谢浓度，降低由于高HCY血症导致的出生缺陷风险。本文中研究发现，CC型受试者口服叶酸前后平均HCY浓度变化无统计学意义，而突变型CT、TT受试者口服叶酸前后平均HCY浓度变化比较明显，口服后的浓度要低于口服前，这与国内研究结果一致[15]，表明口服大剂量的叶酸对于MTHFR C677T基因突变型的育龄女性降低体内的HCY浓度，减少HCY淤积起着非常重要的作用。

综上所述，通过检测本地区育龄女性MTHFR C677T基因多态性，因地制宜的制定个体化的叶酸增补方案，对于降低高HCY血症，减少婴幼儿出生缺陷率有一定的预防指导意义。

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(学术编辑：杨健)

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Study on the relationship between the MTHFR gene polymorphism of fertile women and the level of HCY

YANG Feng-mei1,YU Yan2,ZHANG Li-ping1

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,Hubei;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,JiangyanDistrictTaiyuHospital,Taizhou225500,Jiangsu，China)

Objective：To detect the MTHFR gene polymorphism,the HCY levels and analyze the correlation of MTHFR C677T gene polymorphism and the HCY levels in childbearing age women.Methods：Gene chip method was used to examine the polymorphism,and given dose of folacin 800 μg for a month, and the level of HCY was analyzed by cyclophorase assay in 100 women of childbearing age.Results：Detection rate of gene polymorphism were 26%,54%,20% in CC,CT,TT;before oral folic acid,the HCY levels were 9.5±3.4,11.8±3.1,15.3±3.5 in CC,CT,TT,after oral folic acid,the HCY levels were 8.1±2.8,8.4±2.7,11.0±3.3 in CC,CT,TT.CC genotype groups resulted in no significant difference (P>0.05),and CT,TT genotype groups resulted in significant differences (P<0.05).Conclusion：Oral folic acid can reduce the HCY levels caused by the MTHFR gene C677T mutation;a reasonable folic acid supplementation can prevent birth defects caused by high HCY levels.

MTHFR;HCY;Folic acid;Gene polymorphism

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.02.16

太和医院院级项目(2014JJXM019)

2015-06-09

杨丰美(1982-)，女，主治医师。 通讯作者：张丽萍，E-mail：29256175@qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160425.1131.032.html

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